Конфокальные микроскопы. Kонфокальная лазерная сканирующая микроскопия Лазерная конфокальная микроскопия

В конфокальном микроскопе, благодаря пинхолу, проводится детекция флуоресценции в одном участке объекта, находящемся в фокусе, с минимальным влиянием флуоресценции окружающих участков за счет перестройки оптической системы в каждый момент времени . Такой способ позволяет значительно повысить разрешающую способность микроскопа по всем трём осям, и избежать засвечивания от подлежащих слоёв образца и слоёв лежащих над плоскостью наблюдения. В качестве источника света используется лазер. За объективной линзой находится небольшая диафрагма. Это нужно чтобы испускаемый свет, проходил через нее и регистрировался, а свет других точек, задерживался диафрагмой и лазер освещает не все поле зрения. В результате визуализация проводится в рамках одного оптического среза. В ходе работы проводится съёмка серии оптических срезов образца или перестройки, на основании чего можно получить его трёхмерную реконструкцию . Однако необходимость сканирования множества участков замедляет процесс работы, и конфокальный микроскоп может получить всего несколько изображений в секунду . Ещё одним фактором, замедляющим работу конфокальных микроскопов, является переход от одного оптического среза к следующему. Сканирующие конфокальные микроскопы, как правило, основаны на следующем принципе: образец фиксируется на определённом уровне, изображение считывается под контролем гальванометрического сканера, затем образец перемещается по вертикальной оси и процедура повторяется . Ускорить процесс сканирования можно сократив затраты времени на каждую точку, однако это снижает чувствительность метода и соотношение сигнал/шум. Скорректировать падение чувствительности можно было бы путём повышения интенсивности освещения, но в этом случае возможно повреждение образца светом и его обесцвечивание .

В системе конфокальной микроскопии единичный пинхол системы заменяется множеством пинхолов, обеспечивающих освещение и получение изображений многих точек образца единовременно. Эти пинхолы расположены на вращающемся по спирали, обеспечивая, в итоге, равномерное освещение образца . Чтобы между отверстиями не происходило засвечивания, они должны находиться на расстоянии, равном десяти их диаметрам, друг от друга . С помощью подобных систем можно получить изображение препарата гораздо быстрее - за одну секунду конфокальные микроскопы на основе системы позволяют получать десятки и сотни изображений.

Конфокальная микроскопия сочетает возможность наблюдения тонких оптических срезов, с высокой чувствительностью флуоресцентной микроскопии. Метод хорошо подходит для исследований динамики цитоскелета, движения везикул и органелл, и других задач, связанных с прижизненным наблюдением клеток. Он является более щадящим по отношению к живым клеткам благодаря тому, что продолжительность освещения каждого участка образца значительно сокращается по сравнению обычным конфокальным микроскопом. Систему можно собрать как на прямом, так и на инвертированном микроскопе, но, всё же, предпочтительно использовать инвертированный , поскольку такой дизайн микроскопа позволяет исследовать живые объекты и культуры клеток.

Для съёмки изображений, получаемых путём микроскопии, может использоваться конфокальный микроскоп c камерой ПЗС, а не детекторы на основе фотоумножителей. Детекция с использованием фотоумножителя позволяет значительно усилить сигнал, но создаёт дополнительные шумы. Охлаждаемые ПЗС-камеры микроскопа, напротив, позволяют получать прижизненные изображения крупного формата, с меньшим количеством шумов .

Двойная система был предложен компанией Yokogawa Electric Corporation. Вторая фокусирующая система при этом расположена так, чтобы встроенные в него линзы располагались перед отверстиями на первом, он осуществляет фокусирование света. Сейчас это наиболее распространённые системы для сборки конфокальных микроскопов. Размер используемых в них пинхолов фиксирован, он оптимален 100× увеличения. Пинхолы систем Yokogawa имеют диаметр 50 мкм, через каждый из них может быть получено изображение фрагмента оптического среза диаметром 500 нм. Синхронизация скорости и длительности съёмки определяет качество изображения .

При использовании эффекта полного внутреннего отражения (TIRF) конфокального микроскопа можно получить сведения о процессах, происходящих в тонком поверхностном слое образца, например, непосредственно под мембраной. Для этого используется рассеяние небольшого количества света в виде затухающей волны при полном внутреннем отражении лазерного луча на границе раздела сред. Система, работающая на данном принципе, может быть объединена с системой в составе одного конфокального микроскопа. Для переключения между режимами необходима турель, удаляющая фильтры при микроскопии с использованием системы переключения между камерами. Методики активного освещения - фотообесцвечивание, фотоактивация и фотоконверсия флуорохромов, предназначены для исследования динамических процессов в клетке. Они могут быть реализованы на микроскопе, оснащённом данной системой лазерной сканирующей микроскопии, с использованием отдельных источников света. В сканирующих конфокальных системах фотообесцвечивание проводится с помощью того же лазера, что и получение изображения за счёт изменения его интенсивности, в результате одновременно проводить эти процедуры нельзя, что затрудняет исследование молекул с высокой подвижностью . Для качественной обработки полученных изображений требуются большие вычислительные мощности компьютера. Производители медицинского оборудования выпускают новейшие образцы данного вида оборудования, которые разделяют лазерный луч возбуждения и люминесценцию. Оборудование получило широкое применение в области биофизики, медицины, молекулярной и клеточной биологии.

Таким образом, спиннинг диск конфокальная микроскопия - представляет собой экономичный и точный способ исследования биологического материала с высоким разрешением, во многом заменяющий конфокальную микроскопию, прежде всего при решении задач, связанных с наблюдениями за живыми объектами. Развитие метода и разработки компании Andor позволили создать конфокальные системы, позволяющие работать без использования лазерных источников света, что снизило стоимость оборудования для исследований подобного класса.

1. Wilson T. Spinning-disk microscopy systems / Cold Spring Harb Protoc. 2010. - 2010. - V.11.
2. Thorn K. Spinning-disk confocal microscopy of yeast / Methods Enzymol.- 2010. V. 470.- P.581-602.
3. Winter PW, Shroff H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging / Curr Opin Chem Biol. - 2014. - V.20. - P. 46-53.
4. Stehbens S, Pemble H, Murrow L et al. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods Enzymol. - 2012. - V.504. - P.293-313.

Конфокальный микроскоп Nikon. Изображение дендритной клетки, выделенной из костного мозга, экспрессирующей химерный белок MHC II -GFP (5 мкм). Vyas JM . Insights into dendritic cell function using advanced imaging modalities / Virulence. - 2012. - V.3, N.7. - P. 690-694. Конфокальная микроскопия

Прижизненное изображение распределения нейтрофилов в эмбрионе D. rerio. A,B - конфокальная микроскопия, C, D. Lam PY1, Fischer RS, Shin WD, Waterman CM, Huttenlocher A. Spinning disk confocal imaging of neutrophil migration in zebrafish / Methods Mol Biol. - 2014. - V.1124. - P.219-33.

Обычные классические микроскопы не всегда эффективны при проведении сложных исследований. Если для наблюдения крупных объектов их качеств бывает достаточно, то для исследования клеток они дают искажения. Конфокальные приборы лишены многих недостатков обычного микроскопа. В них есть важный элемент - диафрагма, - который отсекает поток фонового рассеянного света.

Каждую единицу времени регистрируется изображение только от одной точки объекта. Это реализуется за счет диафрагмы микроскопа, расположенной за линзой объектива. Она пропускает свет от одной точки, а свет от других точек задерживается. В следующий момент времени оптическая конфокальная система перестраивается (либо перемещается образец), и в диафрагму попадает свет от другой точки. Затем эти точки складываются в единую картину.

Лазером освещается не весь образец, а только определенная его точка, свет от которой и попадает в диафрагму. Соседние области становятся вторичными источниками света, однако диафрагма их отсекает. Регулируя диаметр диафрагмы, наблюдатель может точно устанавливать толщину оптического слоя у фокуса лазерного луча. Тем самым обеспечивается более качественное изображение по оси Z, что является проблемой для многих обычных микроскопов.

Управляет оптической системой компьютер. Наблюдателю не нужно смотреть в окуляр: изображение обрабатывается программой и выводится на экран монитора. Очень важно правильно установливать микроскопы, так как они чувствительны к вибрациям. Для удобства работы и передачи информации, компьютер микроскопа оснащается USB-портами и возможностью подключения к локальной сети и Интернет. Жесткий диск должен быть вместительным, чтобы хранить большое количество информации.

В этой книге в краткой форме изложен материал, необходимый для освоения современных методов конфокальной лазерной микроскопии. Часть из описанных в тексте практических приемов разработана и усовершенствована авторами издания. Отличительной особенностью данной книги является сочетание ключевых моментов из теории современных методов микроскопии с примерами использования различных приемов конфокальной микроскопии и иммуноцитохимии на практике. В приложениях приводятся необходимые сведения о спектральных характеристиках флуорохромов и протоколы иммуноцитохимических реакций, использованных авторами для получения изображений препаратов и построения трехмерных реконструкций микроскопических объектов. Настоящее руководство может являться справочным пособием для специалистов, применяющих в своей работе флуоресцентные методы и конфокальную микроскопию, а также будет полезно для студентов биологических и медицинских факультетов, изучающих морфологические и нейробиологические дисциплины.

* * *

компанией ЛитРес .

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ – ПРИНЦИПЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ

Большинство биологических объектов обладают низким контрастом внутренних структур, которые в основном прозрачны, поэтому возможности их наблюдения методом классической микроскопии светлого поля ограничены. Эта проблема может быть преодолена несколькими путями: применением метода исследования в темном поле, использованием метода фазового контраста, для двулучепреломляющих материалов применяют поляризационный контраст. Основным же методом контрастирования в биологии является окрашивание препаратов веществами, способными связываться с препаратом и поглощать свет или флуоресцировать. Последние называют флуорохромами.

1.1. Основные понятия

Флуорохромы (флуоресцентные красители)1 – это вещества, которые способны связываться с объектом и расходовать часть энергии поглощенного света на флуоресценцию. Под флуоресценцией понимают способность ряда веществ после поглощения света с одной длиной волны излучать свет с другой длиной волны. Напомним, что электроны в атомах расположены на энергетических уровнях; расстояние между уровнями является характеристикой молекулы. При облучении вещества светом возможен переход электронов на более высокий энергетический уровень. Разница энергии между энергетическими уровнями и частота колебаний поглощенного света связаны между собой уравнением Бора (постулат Бора):

где ΔЕ – разность энергий между уровнями; v – частота; λ – длина волны; h – постоянная Планка; с – скорость света.

После поглощения света часть полученной системой энергии расходуется в виде тепла, а часть может быть излучена в виде фотона. Согласно правилу Стокса, длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого, или, другими словами, максимум спектра излучения сдвинут по отношению к максимуму спектра поглощения в сторону более длинных волн. С физическими основами описанных выше процессов более подробно можно ознакомиться в учебнике Р. Фейнмана (2011).

Каждый флуорохром характеризуется определенным спектром поглощения и испускания. Например, один из самых распространенных флуоресцентных красителей – FITC (fluorescein-5-isothiocyanate) – имеет максимум поглощения l ex = 492 нм, а максимум излучения для него составляет l em = 518 нм. Другой распространенный флуорохром, 5-TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine), имеет l ex = 543 нм и l em = 570 нм. На величину стоксова сдвига также влияет полярность среды, в которой находится флуорохром.

Наиболее интенсивной флуоресценции флуорохрома можно добиться, облучая его светом с длиной волны, близкой к максимуму поглощения, однако возможно перевести флуорофор в возбужденное состояние и при облучении его светом с длиной волны, существенно отличающейся от его максимума поглощения. Например, флуорофор можно перевести в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами (мультифотонное возбуждение), что будет эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Так, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм.

Еще одной характеристикой флуорохрома является квантовый выход – отношение интенсивности поглощаемого и испускаемого света. Квантовый выход (Q ) может быть выражен через отношение интенсивности флуоресценции (F ) к разности интенсивностей падающего (I 0) и выходящего (I ) световых потоков:

Заметим, что квантовый выход всегда меньше единицы из-за «стоксовских» потерь. В зависимости от квантового выхода флуорохромы разделяют на слабые и сильные. Современные синтетические флуорохромы, как правило, обладают высоким квантовым выходом и являются сильными.

Для характеристики способности флуорохрома поглощать свет определенной длины волны вводят понятие молярного коэффициента экстинкции, который определяется как оптическая плотность одномолярного раствора вещества при толщине светопоглощающе-

го слоя в 1 см. Молярный коэффициент поглощения имеет размерность л ⋅ моль - 1 ⋅ см - 1 . Он зависит от природы вещества и от длины волны проходящего света. Величина, полученная путем перемножения молярного коэффициента экстинкции на величину квантового выхода, характеризует яркость флуоресценции флуорохрома при заданной длине волны. Время облучения, при котором флуорохром теряет 50 % яркости, называют фотостабильностью. «Идеальный» флуорохром должен иметь высокий квантовый выход и хорошую фотостабильность. Современные флуорохромы на основе полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек) по этим показателям на порядок превосходят органические соединения (Олейников В. А., 2011).

Еще один важный параметр - время жизни возбужденного состояния , которое определяется как среднее время нахождения молекулы в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Время затухания флуоресценции флуорохрома (τ) описывается формулой:

где Г – константа скорости излучательной дезактивации флуорофора; k – обобщенная константа скорости безызлучательной дезактивации.

Обычно время затухания флуоресценции составляет около 10 нс.

Тушением флуоресценции называют любые процессы, которые уменьшают интенсивность флуоресценции данного вещества. К тушению может приводить множество процессов: химические реакции в возбужденном состоянии, перенос энергии, образование комплексов, тушение при столкновениях. К тушению флуоресценции относятся также процессы кажущегося тушения, которое обусловлено оптическими свойствами образца (высокая оптическая плотность, мутность). Для тушения флуоресценции требуется контакт между молекулами флуорохрома и тушителя. Если тушитель диффундирует к флуорохрому, пока последний находится в возбужденном состоянии, и в результате контакта флуорохром возвращается в основное состояние без излучения фотона, говорят о динамическом тушении. Статическое тушение происходит при образовании нефлуоресцирующего комплекса между флуорохромом и тушителем. При увеличении концентрации флуорохрома возможно самотушение флуоресценции как результат поглощения молекулами вещества собственного излучения. Возможно также поглощение флуоресцентного излучения одного флуорохрома другим. К тушителям флуоресценции относят молекулярный кислород, ароматические и алифатические амины, ксенон, пероксид водорода, акриламид, оксид азота, нитрометан, нитроксиды, хлороформ, трихлорэтанол, бромбензол. Следует отметить, что не все флуорохромы тушатся любыми из вышеперечисленных веществ, однако (в зависимости от условий эксперимента) почти всегда можно подобрать эффективную пару флуорохром-тушитель или, напротив, избежать тушения флуоресценции (что более важно в морфологических исследованиях).

Для флуорохромов характерна анизотропия флуоресценции . Анизотропия – это зависимость свойств вещества от направления. При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются только те молекулы флуорохрома, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего излучения. Такое селективное возбуждение частично ориентированного набора флуорохромов приводит к частично поляризованному испусканию флуоресценции. В общем случае анизотропия флуоресценции r выражается формулой:

где Iv и Ih – интенсивности флуоресценции вертикально и горизонтально поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикально поляризованным светом.

При планировании экспериментов с использованием флуорохромов, особенно флуорохромов нового поколения – квантовых точек – необходимо учитывать возможность мерцания флуоресценции. Это стохастический процесс перехода флуорохрома из флуоресцирующего состояния в состояние отсутствия флуоресценции, несмотря на постоянное возбуждение. В результате, при наблюдении за одиночными флуоресцирующими комплексами возникает стробоскопический эффект (зрительная иллюзия неподвижности или мнимого движения предмета при его прерывистом наблюдении). Кроме этого, поскольку время нахождения флуорохрома во «включенном» и «выключенном» состоянии является случайным, сравнение результатов независимых экспериментов при использовании таких флуорохромов затруднено. При конфокальной микроскопии данный эффект может быть компенсирован за счет линейного или покадрового усреднения сканируемых изображений.

1.2. Устройство флуоресцентного микроскопа

Прототип флуоресцентного микроскопа был разработан в начале ХХ в. Августом Келлером, который при конструировании микроскопа использовал в качестве источника света дуговую кадмиевую лампу. Затем немецкий физик Генри Фридрих Зидентопф, работая в оптических мастерских Цейса (в 1907 – 1938 гг. директор лаборатории микроскопии), совместно с Рихардом Зигмонди изобрел (1903) щелевой ультрамикроскоп. Еще через восемь лет (1911) Oskar Heimstдdt сконструировал первый флуоресцентный микроскоп и применил его для исследования явления автофлуоресценции органических и неорганических объектов. Однако в то время было трудно добиться эффективного разделения флуоресцентного сигнала от возбуждающего света. Эта проблема была преодолена Philipp Ellinger и August Hirt в 1929 г., которым удалось разработать так называемый эпифлуоресцентный микроскоп. В предложенной ими конфигурации микроскопа освещение препарата и детекция флуоресцентного сигнала осуществлялась с одной стороны от образца, поэтому объектива достигал только отраженный возбуждающий и излучаемый свет. Прорыв в развитии флуоресцентной микроскопии связан с появлением лазеров (60-е гг. XX в.), с помощью которых удалось добиться высокой степени пространственной и временной когерентности светового пучка. Кроме того, стало возможным эффективно разделять сигналы, используя дихроичные зеркала.

Принципиальная схема современного флуоресцентного микроскопа представлена на рис. 1.

Свет от источника проходит через фильтр возбуждающего излучения. При этом из спектра выделяются только те компоненты, которые необходимы для возбуждения флуоресценции. Затем свет попадает на дихроичное зеркало (светоделитель). Отраженный светоделителем свет попадает в объектив флуоресцентного микроскопа и фокусируется на образце, возбуждая флуоресценцию. Флуоресцентный сигнал (смещенный в длинноволновую область (согласно Правилу Стокса)) , а также рассеянное излучение возбуждения достигает светоделителя, но, в отличие от возбуждающего света, проходит через дихроичное зеркало, после чего рассеянное излучение отсеивается эмиссионным фильтром и на детектор попадает только излучение флуоресценции.

Источник возбуждающего света. В настоящее время используются три типа источников света: лампы высокой мощности (ртутные, ксеноновые и их аналоги), диоды и лазеры. Ртутная лампа – это газоразрядный источник света, в котором при электрическом разряде в парах ртути под высоким давлением возникает оптическое излучение преимущественно в ультрафиолетовой области спектра. Такие источники света являются малоэффективными, поскольку они производят большое количество избыточной тепловой и световой энергии по сравнению с энергией, требуемой для возбуждения флуоресценции. Флуоресцентные микроскопы могут быть укомплектованы ртутными лампами мощностью 50 – 200 W. Использование более мощной лампы позволяет возбудить с достаточной эффективностью даже слабый флуорохром, но при этом необходимо учитывать, что увеличение мощности лампы влечет за собой увеличение скорости выгорания флуорохромов.

Рис. 1. Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа

В ксеноновой лампе вспышка происходит после ионизации газа и прохождении через него мощного импульса электрического тока, поданного на поджигающий электрод. В результате этого электроны в молекуле ксенона занимают орбиты с более высокими энергетическими уровнями и, возвращаясь на прежние орбиты, излучают энергию в виде фотонов. Ксеноновая лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, что не всегда пригодно для возбуждения флуоресценции. Такие лампы обычно используют при работе с флуорохромами, требующими для возбуждения длинноволновый свет (красной и инфракрасной области).

Вместо ртутной или ксеноновой лампы можно использовать металлогалогенную лампу (metal halide lamp ). Это газоразрядная лампа высокого давления. Внутри колбы размещается кварцевая или керамическая цилиндрическая горелка, в которой находятся галогениды некоторых металлов (йодиды натрия, таллия, индия и др.), инертный газ (преимущественно ксенон и аргон) и металлическая ртуть. При подаче на лампу питающего напряжения происходит зажигание дугового разряда, металл начинает испаряться, его атомы возбуждаются, что приводит к возникновению излучения. В зависимости от состава металлов различаются и спектры излучения ламп. Обычно компоненты подбираются так, чтобы компенсировать недостаток красного и желтого света в спектре ртути, что немаловажно при использовании возбуждаемых светом этого диапазона флуорохромов (например, флуоресцеина). Кроме этого, лампы данного типа компактны, экономичны в использовании, для них характерен пониженный уровень тепловой отдачи.

Источник возбуждения флуоресцентного излучения может быть выполнен в виде одного или нескольких светоизлучающих диодов, причем возможно использование диодов, имеющих как одинаковую длину волны излучения, так и различную. Применение светодиодов позволяет избежать нагревания системы, увеличивает срок ее эксплуатации.

Лазеры в качестве источника света используются в основном в сканирующих устройствах для обеспечения высокой интенсивности освещения в узкой спектральной области и на малой площади образца. В таких микроскопах остросфокусированные световые лучи лазера сканируют образец точку за точкой. Поскольку лазеры испускают свет в узкой спектральной области, пропадает необходимость применения возбуждающих светофильтров. Однако при использовании флуорохромов, которые возбуждаются на разных длинах волн, требуется применять разные лазеры или же прибегать к различного рода приемам.

Фильтры.

Фильтр возбуждающего света подбирается таким образом, чтобы он выделял из спектра лампы свет той длины волны, которая максимально эффективно поглощается флуорохромом. Например, выпускаются светофильтры под стандартные флуорохромы для «синей», «зеленой», «красной» люминесценции или под несколько стандартных флуорохромов (например, возбуждающий светофильтр BP 560/40 нм для «красной» люминесценции или возбуждающий светофильтр под несколько флуорохромов BP 370/40, BP 474/28, BP 585/35 нм производства фирмы Carl Zeiss).

Дихроичные зеркала (интерференционные светофильтры) имеют специальное интерференционное покрытие, позволяющее отражать свет, длина волны которого меньше определенного значения, и пропускать излучение с большей длиной волны. В данном случае возбуждающее излучение отражается, а сигнал флуоресценции полностью пропускается. Для получения таких фильтров на поверхность прозрачной пластины наносят несколько (от 10 до 200) слоев материала с чередующимися высоким и низким показателями преломления. Например, PbCl2, TiO2, ZnS (показатель 2,2 – 2,3) и MgF 2 , SiO 2 , Na 3 AlF 6 (показатель 1,3 – 1,4). Толщина каждого слоя тщательно выдерживается (используется техника вакуумного напыления), поскольку этот параметр определяет положение максимума кривой пропускания. От числа слоев зависит ширина зоны пропускания фильтра и степень подавления «ненужной» части спектра.

Запирающие фильтры (band pass BP). При конструировании запирающих фильтров используют комбинацию длинноволновых отрезающих (shot pass filter, или SP filter) и длинноволновых пропускающих (long pass filter, или LP filter) фильтров. Первые задерживают длинноволновый свет, но пропускают коротковолновый, а LP-фильтры, напротив, пропускают длинноволновый свет, задерживая коротковолновый. Комбинируя эти фильтры, можно добиться того, что через фильтр будет проходить только свет определенного участка спектра. Запирающий фильтр выбирают в соответствии с фильтром возбуждающего света. Например, при установке возбуждающего светофильтра BP 560/40 нм используют запирающий светофильтр BP 630/75 нм.

Сближение в пространстве всех светофильтров позволило объединить их в единый светоделительный модуль. Такая конструкция обеспечивает производство легкой замены или смены модуля и дает возможность применять несколько флуорохромов одновременно, с высокой точностью совмещая полученные изображения. При приобретении флуоресцентного микроскопа необходимо серьезно подходить к вопросу о выборе светоделительных модулей, принимая во внимание поставленные задачи и спектральные характеристики имеющихся флуорохромов. Если планируется использовать несколько флуоресцентных красителей, необходимо учитывать, что спектры излучения флуорохромов не должны перекрываться. В противном случае возможны ошибки в интерпретации данных.

Детекторы флуоресцентного сигнала. Усиление и детектирование сигнала производится с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) и цифровой видеокамеры. ФЭУ – это электровакуумный прибор, в котором поток электронов, излучаемый фотокатодом, усиливается в умножительной системе в результате вторичной электронной эмиссии. В результате фотоэффекта при попадании фотона на фотокатод из него вылетают электроны, которые, ускоряясь в электрическом поле, направляются на систему динодов (специальный электрод), где за счет вторичной электронной эмиссии образуют нарастающую (от динода к диноду) электронную лавину, поступающую на анод. Обычно коэффициент усиления ФЭУ (число электронов, достигших анода при выбивании из фотокатода одного электрона) составляет около 10 6 , что позволяет получить на выходе ФЭУ легко регистрируемый сигнал.

Цифровые камеры в качестве светочувствительного элемента имеют CCD-матрицу (charge-coupled device), она же ПЗС-матрица (сокр. от «прибор с зарядовой связью»). CCD-матрица является специализированной интегральной аналоговой микросхемой, которая представляет собой набор резисторов. Количество этих ячеек (элементов) в матрице является основной определяющей разрешения и качества картинки. Принцип работы CCD-матрицы следующий: свет, попавший на матричные элементы, преобразуется в электрический заряд, формируется зарядовая картина, которая пропорциональна освещенности в каждой ячейке. Матрица может «накапливать» заряды в течение определенного периода времени. Общий заряд, накопленный в ячейке, равен произведению зарядов на время экспонирования. Для получения цветной картинки, как правило, световой луч еще проходит через набор специальных светофильтров/призм зеленого, синего и красного цвета. С более подробным описанием принципов работы отдельных модулей флуоресцентного микроскопа можно ознакомиться в пособии В. И. Голышевской [и др.] (2008) и в работе H. C. Ishikawa-Ankerhold (2012).

1.3. Принципы конфокальной микроскопии

Конфокальная микроскопия является разновидностью флуоресцентной микроскопии с улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива, которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации флуоресценции. Концепция конфокальной микроскопии была предложена Marvin Minsky в 50-е гг. XX в. для исследования ткани головного мозга без предварительного окрашивания. В разработанном им микроскопе свет последовательно фокусировался на разных точках образца. С целью устранения шумового сигнала от участков, расположенных вне плоскости фокуса, использовалась диафрагма. Она находилась в плоскости, сопряженной с плоскостью фокуса объектива, таким образом, что при проецировании диафрагмы на объект ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. При таком устройстве системы свет из областей вне фокуса задерживался диафрагмой и на детектор попадал только сигнал из фокуса объектива. Изменяя диаметр диафрагмы, можно было варьировать толщину оптического слоя вблизи фокуса объектива, от которого измерялся сигнал. Сканирование плоскости образца по точкам позволяло получить полное изображение. Исходя из этого принципа, возникло и название метода – «конфокальный» – основанный на сопряжении фокусов. Однако при таком устройстве микроскопа на изображении было слишком много помех из-за использования слабых источников освещения. Вероятно поэтому изобретение Minsky осталось почти без внимания. Интерес к нему вернулся только после изобретения лазера. Более подробно исторические аспекты создания конфокального микроскопа приведены в обзоре Н. Н. Лукашевой [и др.] (2008).

В современном конфокальном микроскопе источником возбуждающего света является лазер. Преимуществом лазеров по сравнению с ламповыми источниками света заключается в монохроматичности генерируемого света и малой расходимости светового пучка. Монохроматичность возбуждающего флуоресценцию света дает возможность расширить спектральный диапазон регистрируемой флуоресценции и улучшить подавление светорассеяния на длине волны возбуждения. Малая расходимость пучка света способствует более эффективной работе оптической системы микроскопа, уменьшает число бликов, связанных с отклонением света от расчетного оптического пути, улучшает точность фокусировки пучка света и уменьшает объем, в который можно сфокусировать свет на образце. На рис. 2 показана принципиальная схема современного лазерного конфокального микроскопа.

Лазер излучает свет, формируя узкий световой пучок. Затем свет проходит через систему линз (расширитель пучка) и попадает на светоделитель, который отражает возбуждающий свет, направляя его на систему зеркал (на схеме не показана), позволяющих изменять направление луча во взаимно перпендикулярных плоскостях. Светоделитель обеспечивает высокоэффективное отражение света на длине волны генерации лазера и почти стопроцентное пропускание света в остальном спектральном диапазоне. Далее свет через объектив фокусируется в определенной точке образца, возбуждая флуоресценцию. При этом лазерный луч может возбуждать флуоресценцию во всех слоях образца, через которые он проходит, а интенсивность флуоресценции будет возрастать по мере приближения к точке фокусировки. Флуоресцентное излучение собирается объективом и возвращается на светоделитель, проходит сквозь него, попадая на эмиссионные фильтры. Отраженное излучение лазера через светоделитель не проходит. При необходимости многоканальной регистрации (например, при использовании нескольких флуорохромов) возможно дополнительное деление флуоресцентного сигнала на составляющие с помощью дополнительных светоделителей и фильтров эмиссии. Собранный из определенной точки образца свет фокусируется в плоскости конфокальной диафрагмы (pinhole), попадает на детектор (ФЭУ) и оцифровывается. При этом свет, исходящий из областей, находящихся выше или ниже плоскости фокуса, отсекается диафрагмой и на детектор не попадает. После регистрации флуоресцентного сигнала от первой точки фокусировки при помощи системы зеркал луч возбуждающего света перемещается на следующую точку в образце. Весь процесс повторяется. Так, точка за точкой, формируется изображение в горизонтальной (или вертикальной) плоскости.

Рис. 2. Принципиальная схема простейшего конфокального микроскопа

Диаметр конфокальной диафрагмы можно варьировать, тем самым изменяя толщину оптического слоя, от которого регистрируется сигнал. Однако следует понимать, что уменьшение диаметра конфокальной диафрагмы (а, следовательно, и уменьшение толщины оптического слоя) приводит к снижению интенсивности света, который диафрагма пропускает к детектору и, соответственно ухудшению детекции объектов с неяркой флуоресценцией. В связи с этим приходится искать компромисс между разрешением по оси z , зависящим от размера конфокальной диафрагмы, и возможностью регистрации четких флуоресцирующих объектов, что зависит как от размера диафрагмы, так и от степени усиления регистрируемого сигнала.

Помимо диаметра конфокальной диафрагмы толщина оптического слоя зависит от длины волны возбуждающего света, числовой апертуры объектива, показателя преломления иммерсионной среды. В частности, чем больше числовая апертура объектива, тем меньше толщина оптического слоя.

Не менее важным параметром является разрешающая способность микроскопа. Вследствие дифракции света увеличенное изображение объекта может оказаться размытым (две или более точек объекта воспринимаются глазом как одна). Еще в XIX в. Джон Рэлей сформулировал принцип, в соответствии с которым предельное разрешение микроскопа не может быть больше половины длины волны освещающего объект света. Предел разрешения объектива микроскопа (l min) был уточнен немецким физиком Г. Гельмгольцем:

l min = 0,61λ/ n sin α,

где λ -длина волны света; n – показатель преломления иммерсионной среды; α -апертурный угол (максимальный угол, который образуют лучи, попадающие в объектив, с оптической осью системы).

Выражение NА = n sin α называют числовой апертурой.

Согласно формуле Гельмгольца, разрешение объектива микроскопа зависит от длины волны облучающего света и пропорционально числовой апертуре. Повысить разрешение также можно с помощью увеличения коэффициента преломления иммерсионной среды. Поскольку невозможно неограниченно уменьшать длину волны облучающего света и увеличивать числовую апертуру объектива, существует разрешающий предел – около 200 нм. Однако есть возможность улучшить качество изображения за счет увеличения контраста. Если установить диаметр конфокальной диафрагмы равным диаметру центрального пятна дифракционной картины точечного объекта (диску Эйри), то можно избежать попадания в объектив света от дифракционных колец. Применяя такую технологию, можно повысить контрастность примерно в 1,4 раза по сравнению с обычными микроскопами, а это приведет к заметному улучшению качества изображения. Аксиальное разрешение конфокального микроскопа также зависит от диаметра диафрагмы. Чем меньше диаметр диафрагмы, тем меньше толщина слоя, с которого снимается сигнал, следовательно, лучше аксиальное разрешение (свет из соседних точек, находящихся вне фокальной плоскости, задерживается диафрагмой). Величина конфокальной диафрагмы, равная размеру диска Эйри, рассчитывается программой, управляющей конфокальным микроскопом, для каждого сочетания объектива и используемых фильтров (1 Airyunit). Она легко может быть задана без дополнительных вычислений.

С более подробным описанием принципиальной схемы конфокального микроскопа и порядком работы его модулей можно ознакомиться в работах Э. И. Лежнева [и др.] (2001), Г. И. Штейна (2007); R. Y. Tsien (2006); B. J. Nair (2012).

Как указывалось выше, в конфокальной лазерной микроскопии изображение всего образца получают путем сканирования. Скорость поточечного сканирования ограничивает скорость работы микроскопа в целом и делает невозможным наблюдение за быстротекущими процессами. Чтобы избежать этого ограничения, на практике используют не одиночную диафрагму, а массив диафрагм и детекторов. Такие массивы размещают на диске Нипкова. Это устройство, изобретенное Паулем Нипковым в 1884 г., представляет собой вращающийся диск из непрозрачного материала с нанесенными на нем отверстиями одинакового диаметра, расположенными по спирали в один оборот, начиная от наружного края диска. Наблюдая объект через сектор быстро вращающегося диска Нипкова, можно заметить, что происходит его построчное сканирование. При более высокой скорости вращения объект можно увидеть целиком (Феофанов А. В., 2007).

Современный аналог диска Нипкова содержит 20 тыс. отверстий, на которых лазерный луч фокусируется при помощи дополнительного диска с микролинзами. При вращении такого двойного диска достигается считывание до 360 кадров в секунду. Однако стоит отметить, что диаметры отверстий и расстояния между ними на диске фиксированы и подбираются для конкретного объектива, следовательно, смена последнего требует замены диска.

Сегодня на смену вращающимся дискам Нипкова приходят их твердотельные неподвижные аналоги – цифровые микрозеркальные устройства (digital micromirror device, DMD). Эти устройства представляют собой массивы микрозеркал, которые соответствуют пикселям в проецируемом изображении и, отклоняясь в ту или другую сторону, управляют прохождением света. В конфокальной микроскопии они играют роль массива отверстий, фильтрующих возвращаемый образцом сигнал, с изменяемым диаметром и схемой расстановки.

Однако конфокальные микроскопы имеют и существенные недостатки. Так, возбуждение значительной части существующих флуорохромов осуществляется лазерным излучением ультрафиолетового или коротковолнового видимого диапазона, что разрушительно для живых клеток. Эта проблема была преодолена с введением в практику мультифотонных микроскопов, в которых в качестве подсветки используется излучение инфракрасного диапазона.

1.4. Мультифотонная микроскопия

Мультифотонная микроскопия – вариант лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, основанный на принципе Гёпперт-Майер, согласно которому с увеличением плотности мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, после чего атом излучает фотон большей энергии, чем при однофотонном поглощении. Несмотря на то что это явление было описано еще в 1931 г., первый мультифотонный микроскоп был применен для исследования биологических объектов Winfried Denk лишь в 1990 г. Это было связано с невозможностью до появления лазерной техники достичь на практике излучения большой плотности. В современных мультифотонных микроскопах высокая плотность мощности светового пучка обеспечивается за счет фокусировки лазерного излучения, а также благодаря уменьшению длительности лазерного импульса. Для этой цели применяются фемтосекундные лазеры с длительностью импульса около 10 - 13 с (100 фемтосекунд) и частотой порядка 100 МГц. Использование такой системы (при невысокой ее мощности) позволяет получить сигнал с малым уровнем фоновых шумов, достичь большей глубины проникновения в ткани при малой степени повреждения клеток. Кроме этого за счет отсутствия возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального объема отсутствует необходимость установки конфокальной диафрагмы, поэтому лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является типичным конфокальным микроскопом. В качестве примера мультифотонного микроскопа можно привести комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710 с фемтосекундным инфракрасным лазером с перестраиваемым диапазоном (800 – 1500 нм). Использование этой системы позволяет получить глубину проникновения в ткани порядка 500 мкм и осуществлять непрерывный мониторинг живых объектов в течение нескольких часов.

Одним из вариантов мультифотонной микроскопии является микроскопия с использованием регистрации второй гармоники (Second-harmonic imaging microscopy – SHIM). Метод генерации второй гармоники основан на нелинейном оптическом явлении, суть которого заключается в преобразовании средой двух фотонов с частотой w в один фотон с частотой 2w. Это означает, что помимо света на частоте лазера из среды выходит свет на удвоенной частоте – вторая гармоника. Генерация второй гармоники обусловлена рассеянием света в среде и возможна при действии поляризованного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона. Подробное изложение физико-химических основ этого процесса приведено в учебнике под редакцией Б. И. Манцызова (2009). Отметим, что не все биологические образцы могут генерировать вторую гармонику. Классическим объектом для этого вида микроскопии является роговица глаза, которая преимущественно состоит из плотно упакованных коллагеновых волокон – источника генерации второй гармоники.

1.5. Конфокальная микроскопия в применении к исследованию динамических процессов и межмолекулярных взаимодействий

1.5.1. Восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Recovery After Photobleachin – FRAP)

Данная техника применяется для исследования подвижности биоорганических молекул, например для измерения коэффициента латеральной диффузии некоторого белка или для изучения полимеризации белков. Основной принцип метода заключается в том, что белок интереса метят флуоресцентной меткой, с помощью ослабленного аттенюаторами возбуждающего излучения регистрируют фоновую флуоресценцию; после этого на короткий промежуток времени (несколько миллисекунд) увеличивают интенсивность облучения, что приводит к выжиганию флуорохрома; затем снижают интенсивность до исходной и регистрируют флуоресценцию с отбеленного участка (Соболев А. С., 2000). Если молекулы с флуорохромом из соседней необлученной зоны (например, посредством диффузии) перемещаются в облученную область, то по времени нарастания флуоресценции можно судить об их подвижности. Несколько лет назад была разработана модификация этого метода – обратный FRAP или iFRAP, который с успехом применяется для изучения подвижности молекул в малом объеме или кинетики диссоциации молекул. В этой модификации фотоотбеливанию подвергаются флуоресцентно меченые молекулы во всей клетке за исключением малого объема, затем регистрируется изменение уровня флуоресценции в этом объеме (Dailey M. E. [еt al.], 2006).

1.5.2. Потеря флуоресценции во время фотоотбеливания (Fluorescence Lossin Photobleaching – FLIP)

Техника FLIP используется для выявления взаимодействий между молекулами из разных компартментов клетки или для изучения подвижности молекулы внутри компартмента. Например, для наблюдения передвижения определенного белка из цитоплазмы в ядро. Эксперименты в технике FLIP отличаются от FRAP и iFRAP тем, что выжигание флуоресценции в одной и той же области образца производится несколько раз с целью предотвращения восстановления флуоресценции в ней. При повторном отбеливании определенной области возникает потеря флуоресценции в пограничной области. По потере флуоресценции в области пограничной с облучаемой можно судить о передвижении фракции меченных флуоресцентным красителем белков и, наоборот, по остаточной флуоресценции можно определить долю неподвижных молекул. FLIP часто используется в комбинации с FRAP, чтобы получить обобщенную информацию об активном и пассивном перемещении меченых белков.

1.5.3. Локализация флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Localization After Photobleaching – FLAP)

С помощью метода FLAP можно в реальном времени следить за перемещением флуоресцентно меченой молекулы в пространстве. Техника FLAP была разработана Graham Dunn в 2002 г. и состояла в том, что к молекулам интереса пришивали две различные флуоресцентные метки, одну из которых отбеливали, а с помощью второй следили за перемещением молекулы. Для реализации этого метода оба красителя должны визуализироваться одновременно и независимо, тогда FLAP сигнал получают путем вычитания отбеленного сигнала из неотбеленного для каждого пикселя.

1.5.4. Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная передача энергии (Fӧrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer – FRET)

Фёрстеровская резонансная передача энергии, или иначе диполь-дипольный перенос энергии, – это механизм переноса энергии между двумя молекулами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором, находящимся в возбужденном состоянии, и акцептором. Характерная черта данного процесса – тушение флуоресценции донора и возникновение более длинноволновой флуоресценции у акцептора, которая детектируется конфокальным микроскопом. При этом перенос возбуждения сопровождается уменьшением времени жизни и квантового выхода флуоресценции донора, для которого акцептор выступает в роли тушителя. Скорость переноса убывает как r –6 , где r – расстояние между донором и акцептором, что используется для измерения расстояния между двумя молекулами или между двумя метками в одной молекуле. Для характеристики этого явления вводится понятие фестеровского радиуса (R F ) – это эффективное расстояние, на котором скорость перехода составляет 50 % от максимума (для большинства систем его величина составляет 20 – 50 Å). Если расстояние между донором и акцептором превышает 10 нм, то диполь-дипольный перенос энергии не возможен. Помимо расстояния скорость переноса зависит от степени перекрывания спектров испускания донора и поглощения акцептора, от взаимной ориентации диполей донора и акцептора и от времени жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора. Константа скорости переноса энергии k et определяется выражением:

где τ d – время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора.

Для реализации технологии FRET необходимо, чтобы:

1) донорный зонд обладал достаточным временем жизни для осуществления переноса энергии;

2) молекулы донора и акцептора располагались на расстоянии 1 – 10 нм друг от друга;

3) спектр поглощения флуорохрома акцептора накладывался на спектр испускания флуоресценции флуорохрома донора (примерно на 30 %);

4) для переноса энергии ориентации диполя донора и акцептора были примерно параллельны друг другу;

5) пары флуорохромов соответствовали имеющимся в конструкции микроскопа лазерам.

Наиболее часто используемые пары донор – акцептор приведены в обзоре, расположенном на сайте http://www.mdpi.com/ 1420-3049/17/4/4047р. 4088.

Существуют несколько методов исследований FRET: фотоотбеливание акцептора/донора; метод спектральной конфокальной микроскопии в применении к FRET; микроскопия для исследования времени жизни флуоресценции (fluorescence lifetime imaging microscopy – FLIM) и метод поляризации флуоресценции (Ishikawa-Ankerhold Н. С. , 2012). В зависимости от задачи данные модификации метода FRET позволяют следить за конформационными изменениями в белках, изучать кинетику ферментативных реакций, исследовать белок-белковые и другие взаимодействия. Например, по изменению FRET-сигнала между Gá иGâã субъединицами G-белка, слитыми с флуоресцирующими белками CFP и YFP, можно охарактеризовать динамические характеристики диссоциации G-белка в живых клетках; две субъединицы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов á4 и â2, слитые с YFP и CFP, послужили основой для разработки клеточных систем, на основе которых с применением спектральной конфокальной микроскопии показана возможность измерять уровень á4â2-рецепторов и изучать процессы их сборки-диссоциации под воздействием различных стимулов. С помощью методики FLIM смогли в системе реального времени отслеживать уровень фосфорилированной формы эпидермального фактора роста (ЭФР), для чего к ЭФР пришили GFP, а к антителам, реагирующим с фосфоЭФР, – Cy3 (Grigsby C. L. , 2012; Zeug A. , 2012).

Литература

Голышевская В. И., Егорова О. В., Севастьянова Э. В., Шульгина М. В. Люминесцентная микроскопия: учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии». – М.; Тверь: Триада, 2008. – 36 с.

Лукашева Н. Н., Ткаченко С. Б., Потекаев Н. Н., Кузьмина Т. С., Василевская Е. А. Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии // Клиническая дерматология и венерология. – 2008. – № 5. – С. 10 – 15.

Манцызов Б. И. Когерентная и нелинейная оптика. – М.: ФИЗМАТЛИТ, 2009. – 208 с.

Олейников В. А . Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорг. химия. – 2011. – 37 (2). – С. 171 – 189.

Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: учебно-методическое пособие. – СПб.: СОЛО, 2008. – 72 с.

Соболев А. С. Как измеряют подвижность макромолекул в живых клетках // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. – № 4. – С. 2 – 6.

Феофанов А. В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биологической химии. – 2007. – Т. 47. – С. 371 – 410.

Фейнман Р. Фейнмановские лекции по физике:в9 т. – 6-еизд. сущ. испр. – М.: УРСС: Издательский дом «ЛИБРОКОМ», 2011. – Т. 3: Излучение. Волны. Кванты. – 264 с.

Штейн Г. И. Руководство по конфокальной микроскопии. – СПб.: ИНЦ РАН, 2007. – 77 с.

Dailey M. E., Manders E., Soll D., Terasaki M. Chapter 19 Confocal Microscopy of Live Cells In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 381 – 404.

Grigsby C. L., Ho Y. P., LeongK. W. Understanding nonviral nucleic acid delivery with quantum dot-FRET nanosensors // Nanomedicine (Lond). – 2012. – Vol. 7 (4). – P. 565 – 577.

Ishikawa-Ankerhold H. C., Ankerhold R., Drummen G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques – FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM // Molecules. – 2012. – Vol. 17. – Р. 4047 – 4132.

Nair B. J., Sivakumar T. T., Joseph A. P., Varun B. R., Mony V. Confocal microscopy // Health Sciences. – 2012. – 1(3): JS004A. – Р. 1 – 6.

Tsien R. Y., Ernst L., Waggoner A. Fluorophores for Confocal Microscopy: Photophysics and Photochemistry In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 338 – 352.

Zeug A., Woehler A., Neher E., Ponimaskin E. G . Quantitative intensity-based FRET approaches – a comparative snapshot // Biophys. J. – 2012. – Vol. 103 (9). – Р. 1821 – 1827.

* * *

Приведённый ознакомительный фрагмент книги Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии (Коллектив авторов, 2014) предоставлен нашим книжным партнёром -

Конфокальная микроскопия — один из методов оптической микроскопии, обладающий значительным контрастом по сравнению с микроскопами классической схемы за счет использования диафрагмы, отсекающей поток фонового рассеяного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек в основном задерживается диафрагмой.

Повышение контраста изображения также достигается за счет того, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Уменьшение отверстия в диафрагме приводит к уменьшению толщины оптического слоя, что повышает контрастность изображения, однако при этом падает его яркость, что требует использования высокочувствительных регистрирующих систем и в процессе исследования заставляет идти на компромисс между яркостью и контрастом получаемого изображения.

Наиболее часто встречающейся задачей для конфокальной микроскопии, благодаря ее высокому разрешению и контрасту, является изучение структуры клеток и их органелл, например, цитоскелета, ЭПР, лизосом, митохондрий, ядра, хромосом и даже генов. Исследуется также колокализация в клетке двух и более веществ. Еще одна задача - исследование динамических процессов, происходящих в живых клетках. Например, клеточного транспорта биологически-активных соединений, изменений концентрации и распределения ионов кальция. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.

Новыми перспективными направлениями являются методики FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching (Восстановление флуоресценции после фотовыжигания) и FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer (Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса).

Глоссарий:

FRAP применяется для исследования подвижности биоорганических молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения и последующего его рассоединения с молекулами. После выжигания молекулы с флуорохромом из необлученной зоны движутся вследствие диффузии в облученную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно судить о подвижности молекул.

FRET применяется для определения расстояния между молекулами разных типов, их окружения и взаимодействия. Молекулы метятся двумя флуорохромами со спектром испускания донора, перекрывающимся со спектром поглощения акцептора. Энергия от донора к акцептору передается на малых расстояниях (несколько нм) в результате резонанса между энергетическими уровнями, а его вероятность зависит от расстояния между молекулами. Затем акцептор излучает энергию в видимой области спектра, которая регистрируется конфокальным микроскопом.

Двухфотонная (мультифотонная) микроскопия - Two Photon (Multiphoton) Microscopy - Методика, производная от лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, при которой возбуждение флуорохромов осуществляется лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона, плотность которого удваивается или даже утраивается в месте фокусировки на образце. Флуорофоры образца переводятся в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами, что эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Например, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм. Мультифотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в толщу тканей и не требует наличия конфокальной микродиафрагмы, так как ее флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости.

Акусто-оптический перестраиваемый фильтр (AOTF) - Acousto- Optic Tunable Filter (AOTF) - Фильтрующее устройство, использующее звуковые колебания для модулирования длины волны или интенсивности света, испускаемого лазером или некогерентным источником света (в первую очередь дуговыми лампами). Фильтр состоит из специализированного кристалла (оксид теллура или кварц), зажатого с двух сторон акустическими излучателем и поглотителем для наведения в кристалле стоячих акустических волн с переменными зонами высокого и низкого преломления. Если поляризованный или неполяризованный свет проходит через фильтр, кристалл воздействует на него как дифракционная решетка, отклоняющая проходящий луч. Для изменения периода дифракционной решетки выбираются характерные длины стоячих волн, получаемые в результате изменения звуковых колебаний, подводимых к кристаллу.

Полосовой фильтр - Bandpass Filter - фильтр, пропускающий определенный диапазон (полосу) длин волн ослабляя при этом волны большей и меньшей длины, чем у пропускаемых. Длина волны в середине пропускаемой полосы обычно называется средней (английская аббревиатура CWL). Эффективная полоса пропускания измеряется шириной зоны, пропускающей половину от максимума падающего света, которая еще называется полосой половинного пропускания (аббревиатуры FWHM и HBW). В флуоресцентной микроскопии полосовые фильтры чаще используются в тракте возбуждения и реже в качестве пороговых (барьерных) фильтров.

Светоделитель - Beamsplitter - Оптическое устройство, используемое для разделения падающего светового луча на две или более составляющих, каждые из которых проецируются в различных направлениях. Для выполнения каких-либо определенных условий светоделители бывают различных конфигураций. В окулярных блоках оптических микроскопов используются призматические светоделители для одновременного проецирования изображения в окуляры и фотокамеру (цифровую камеру). Для получения линейно поляризованного света применяются поляризующие светоделители из природного кварца - материала с двойным преломлением. В флуоресцентной микроскопии для отражение волн возбуждения обратно к источнику и пропускания более длинноволнового вторичного флуоресцентного излучения к окулярам и детектору в качестве светоделителей используются дихроматичные (дихроичные) зеркала.

Холодное зеркало - Cold Mirror - Специализированный дихроматичный интерференционный фильтр, который в очень широком диапазоне температур отражает весь видимый спектр, но очень эффективно пропускает волны в инфракрасной области. Аналогично горячим зеркалам холодные могут быть разработаны для отражения лучей, падающих под углами от нуля до 45 градусов и представлять собой многослойные диэлектрические покрытия наподобие интерференционных фильтров. Холодные зеркала могут использоваться в качестве дихроматических светоделителей в лазерных системах для отражения видимого света и пропускания инфракрасного.

Дихроматичный светоделитель (дихроичное зеркало) - Dichromatic Beamsplitter (Dichroic Mirror) - Комбинация интерференционных фильтров/зеркал обычно применяемая в наборах фильтров для флуоресцентной микроскопии для получения четко определяемого перехода между пропускаемыми и отраженными длинами волн. Дихроматичное зеркало, наклоненное под углом 45 градусов к падающему свету и испускаемому излучению, отражает коротковолновое излучение возбуждения под углом 90 градусов на образец и пропускает более длинноволновое излучение от образца на окуляры и детектор. Дихроматичные зеркала для флуоресцентной микроскопии, изготовленные с использованием тонких интерференционных пленок способны отразить до 90 % возбуждающего излучения, одновременно пропуская до 90 % полосы флуоресцентного излучения. Дихроматичные зеркала обычно являются центральным (основным) элементом в трех видах фильтров (возбуждения, барьерных и дихроматичных зеркал), находящихся в составе блока флуоресцентных оптических фильтров.

Скат фильтра - Filter Slope - Скат оптического фильтра - это характеристика профиля фильтра в области перехода от запирания к пропусканию. В целом, скат фильтра характеризуется длиной волны, на которой фильтр демонстрирует определенный коэффициент пропускания и крутизну характеристики в этом месте. Два различных фильтра могут иметь одни и те же частоты среза, но совершенно разные уровни запирания и скаты. Фильтры с очень крутыми скатами имеют узкую полосу пропускания, в то время как пологие скаты означают широкую полосу.

Полная ширина на половине максимума - Full Width at Half Maximum (FWHM) - Диапазон длин волн пропускаемых стеклянным или интерференционным фильтром описывается параметром, известным как полная ширина на половине максимума (FWHM). Границы среза определяются как наименьшая и наибольшая длины волн, пропускаемые фильтром на уровне 50% от максимума, а средняя длина волны (CWL или СДВ) представляет собой среднее арифметическое от всех длин волн внутри диапазона. Например, величина FWHM, равная 40 означает, что ширина пропускаемого диапазона волн составляет 40 нм, причем значение СДВ (CWL) может лежать где угодно от ультрафиолетовой до инфракрасной частей спектра. Во многих текстах FWHM может обозначаться как половинная полоса пропускания (half bandwidth, HBW).

Видеокамеры ISIT - Intensifier Silicon- Intensifier Target (ISIT) Camera - Видеокамеры, предназначенные для работы при низком уровне освещения, как например в флуоресцентной микроскопии образцов с очень низким квантовым выходом. Эти камеры как правило включают в себя SIT - трубку (с диодной матрицей) дополненную усилителем изображения в комбинации с волоконной оптикой на первой ступени усиления света.

Ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия (БСОМ ) - Near- Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) - Ближнепольное изображение получается при размещении оптического зонда (световода) субмикронного размера на чрезвычайно близком расстоянии от изучаемого объекта, а свет пропускается через небольшую диафрагму на конце зонда. Под ближним полем понимается зона над поверхностью изучаемого объекта размером меньше длины волны падающего света. В пределах ближнего поля затухающий свет не ограничен дифракцией, и возможно получение информации относительно объектов нанометрового порядка. Это явление позволяет получать изображения за пределами дифракционного барьера и проводить спектроскопию образцов, недостижимую средствами обычной оптической микроскопии.

Конфокальная микроскопия имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционной оптической микроскопией, включая регулируемую глубину поля, исключение ухудшающей изображение внефокусной информации, возможность последовательного анализа оптических срезов толстых образцов. Сущностью конфокального метода является использование пространственной фильтрации для отсечения света от части образца вне фокуса (фоновых засветок), когда толщина образца больше, чем фокальная плоскость. В последние годы произошел взрыв популярности конфокальной микроскопии, отчасти благодаря легкости получения изображений чрезвычайно высокого качества для образцов, подготовленных для традиционной оптической микроскопии, а отчасти благодаря большому количеству приложений во многих областях, представляющих сегодня исследовательский интерес.

Основные понятия

Хотя современные приборы значительно отличаются от самых ранних версий, принцип конфокального получения изображений, выдвинутый Марвином Мински и запатентованный в 1957 году, применяется во всех современных конфокальных микроскопах. В традиционных широкопольных микроскопах весь образец целиком освещается ртутным или ксеноновым источником света, а изображение либо наблюдается визуально, либо проецируется на устройство регистрации изображения или фотопленку. Метод же формирования изображения конфокальным микроскопом принципиально другой. Освещение осуществляется сканированием всей поверхности образца одним или более сфокусированным лучом света, обычно от лазерного дугового источника. Освещенная область образца фокусируется объективом и затем сканируется с помощью сканирующего устройства с управлением через компьютер. Последовательность световых лучей от образца распознается через точечную диафрагму (или, в некоторых случаях, щелевую диафрагму) фотоэлектронным умножителем (ФЭУ), выходные сигналы которого преобразуются в изображение, отображаемое на компьютере. Хотя неокрашенные образцы и можно наблюдать с помощью отраженного от них света, их обычно отмечают одной или более флуоресцентными красителями.

Способы получения изображения

При конфокальной микроскопии для исследования огромного количества образцов разного типа используются различные методы получения изображения. Все они основываются на технической возможности получения изображений высокой четкости, называемых оптическими срезами, в последовательности относительно толстых срезов или всего образца целиком (тотального препарата). Оптический срез является базовым элементом изображения. Сами изображения получаются при наблюдении связанных и окрашенных образцов в режимах одно-, двух-, трех- и многоволнового освещения, при этом изображения, формируемые с помощью различных методик освещения и окрашивания, будут точно соотнесены между собой. Возможно получение изображений живой клетки и развернутой во времени последовательности изображений (регистрация изображений в заданный временной интервал), а численные методы обработки, применяемые к последовательностям изображений, позволяют создать интегрированное целое изображение из серии изображений по оси z и трехмерные изображения образцов., а также представление трехмерных данных во временной последовательности, то есть четырехмерное изображение. В первых конфокальных микроскопах изображения получались с помощью отраженного света, но, в действительности, в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе может быть применен способ получения изображения с помощью любого источника проходящего света, обычно используемого в микроскопии.

Создание изображения

Процедуры подготовки образца и получения его изображения с помощью конфокальных микроскопов - это, в основном, те, которые были разработаны в течении многих лет в традиционной широкопольной микроскопии. В биомедицине главным приложением конфокальной микроскопии является получение изображения связанных или живых клеток и тканей, которые обычно окрашиваются одной или более флуоресцентными метками. Существует большое количество различных флуоресцентных красителей, которые могут быть занесены в относительно простые протоколы и использоваться для окрашивания определенных клеточных органелл и структур. Среди огромного множества доступных красителей имеются, например, красители ядра, аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума, митохондрий, а также такие красители, как флуоресцирующий фаллоидин, указывающий на полимеризированный актин в клетках. Независимо от применяемого способа подготовки образца, главное преимущество конфокальной микроскопии заключается в гибкости способов представления и анализа изображения, являющейся следствием одновременного сбора множественных изображений и их представления в компьютере в цифровой форме.

Критические аспекты конфокальной микроскопии

Получение количественных трехмерных изображений во флуоресцентной микроскопии часто осложнено артефактами, возникающими при подготовке образца, благодаря контролируемым и неконтролируемым экспериментальным величинам или проблемам расположения и компоновки микроскопа. Эта статья, написанная доктором Джеймсом Б. Поли, систематизирует наиболее общие внешние факторы, которые часто «заслоняют» результаты, полученные в широкопольной флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Среди обсуждаемых тем - лазерная система, юстировка оптических компонентов, увеличение объективов, артефакты, связанные с обесцвечиванием, аберрации, иммерсионное масло, толщина покровного стекла, квантовый выход (квантовая эффективность), и среда образца.

Аберрации в многоцветной конфокальной микроскопии

Усовершенствования конструкции упростили конфокальную микроскопию до такой степени, что она стала обычным инструментом проведения исследований в клеточной биологии. Но поскольку конфокальные микроскопы стали мощнее, стали предъявляться более высокие требования к их оптике. На самом деле, оптические аберрации вызывающие незначительные дефекты изображения в широкопольной микроскопии, могут привести к разрушительным последствиям в конфокальной микроскопии. К сожалению, строгие оптические требования в конфокальной микроскопии часто скрыты из-за оптических систем, гарантирующих четкое изображение даже в случае слабого микроскопа. Производители оптики выпускают множество различных объективов для микроскопов, предназначенных для определенных приложений. В этой статье показывается, какое влияние компромиссные решения при создании объективов оказывают на конфокальную микроскопию.

Трехцветная визуализация в конфокальной микроскопии

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ) обычно используется для получения цифровых изображений флуоресцентных образцов, помеченных одной, двумя и тремя метками. Использование красного, зеленого и синего (RGB) цветов наиболее информативно для представления распределения света до трех флуоресцирующих меток клетки, когда для каждого взаимного расположения используется дополнительный цвет и когда изображения разного цвета образуют единую трехцветную картину. В этом разделе мы рассмотрим упрощенную версию недавно опубликованного метода получения трехцветных конфокальных изображений с помощью популярной программы обработки изображений, Adobe Photoshop. В дополнение, обсуждаются несколько приложений по созданию протокола трехцветного изображения для представления конфокальных снимков. Стоит иметь в виду, что эти численные методы не ограничиваются изображениями, полученными ЛСКМ, и могут применяться к цифровым изображениям, импортированным в Photoshop из других источников.

Основы конфокальной отражательной микроскопии

Конфокальная отражательная микроскопия может быть применяться для получения, дополнительной информации об образце, с относительно незначительными дополнительными усилиями, поскольку методики требуют минимальной подготовки образца и перенастройки оборудования. К тому же, в конфокальной отражательной микроскопии информация о неокрашенных тканях также легко доступна, как и данные, получаемые при работе с окрашенными образцами, отражающими свет. Этот метод можно также комбинировать с более распространенными методами исследований в свете флуоресценции. Примерами недавних приложений являются регистрация неокрашенных клеток в популяции флуоресцентно окрашенных клеток и наблюдение взаимодействий между флуоресцентно окрашенными клетками, растущими на непрозрачном структурированном субстрате.

Галерея конфокальных изображений

Галерея конфокальных снимков Nikon MicroscopyU представляет собой последовательность цифровых изображений, полученных с использованием конфокального микроскопа Nikon PCM-2000, объединенного с прямым микроскопом Eclipse E-600. Последовательность изображений оптических срезов в различных плоскостях образца была получена при сканировании вдоль оптической оси микроскопа. Последовательность представлена интерактивным Java - приложением, позволяющим либо «проигрывать» серию срезов автоматически, либо прокручивать их вперед и назад, как слайды.

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

Было разработано несколько методов для преодоления явления плохого контраста, присущего изображениям образцов с большой толщиной, обычно создаваемым микроскопами. Конфокальная и деконволюционная методики создают существенно лучшие изображения образцов средней толщины (от 5 до 15 микрон). Изображения образцов с наибольшей толщиной (от 20 микрон и более) ухудшаются из-за воздействия большого потока внешнего света от внефокусных областей и, возможно, лучше всего получаются методами конфокальной микроскопии. С помощью этого учебного руководства образцы представлены сериями оптических срезов вдоль оси z с помощью виртуального конфокального микроскопа.

Отражательная конфокальная микроскопия

С помощью этого учебного руководства можно исследовать отдельные слои поверхности интегральных микросхем. Цифровые изображения для руководства были получены с помощью отражательного конфокального микроскопа Nikon Optiphot C200. Для каждой серии была записана последовательность оптических срезов по оси z, по мере проникновения и фокусировки микроскопа вглубь (с шагом 1 микрометр) мозаики схем на поверхности кремниевого кристалла.

Основные положения

По сравнению с традиционной, конфокальная микроскопия имеет несколько преимуществ, включая малую глубину проникновения в исследуемый образец, отсутствие фоновых засветок и возможность получать серии оптических срезов образцов большой толщины. В биомедицине главным приложением конфокальной микроскопии является получение изображения связанных или живых клеток и тканей, которые обычно отмечены одной или более флуоресцентными метками.

Рис. 1. Схема хода лучей в конфокальной микроскопии

При получении изображений флуоресцирующих образцов с помощью традиционного широкопольного микроскопа вторичное свечение, испускаемое образцом из областей вне исследования, часто влияет на четкость изображения деталей, находящихся в фокусе. Это особенно проблематично при толщине образцов более 2-х микрометров. Конфокальная микроскопия дает незначительное улучшение разрешения как вдоль оси, так и по плоскости; но именно возможность исключить фоновые засветки, возникающие во флуоресцентно-окрашенных образцах большой толщины, вызвала недавний всплеск популярности этого метода исследования. Будучи относительно простыми в управлении, большинство современных конфокальных микроскопов, стали частью базового оборудования во многих многопользовательских системах по работе с изображениями. Поскольку разрешение, достигаемое лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (ЛСКМ) несколько лучше традиционного широкопольного оптического микроскопа, но все же значительно ниже разрешения просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа, он, в определенном смысле, явился мостом между двумя наиболее распространенными методами исследований. На рисунке 1 представлена принципиальная схема прохождения света в конфокальном микроскопе базовой компоновки.

В традиционных широкопольных микроскопах весь образец целиком освещается ртутным или ксеноновым источником света, а изображение либо наблюдается визуально, либо проецируется на устройство визуализации изображения или фотопленку. Метод же получения изображения конфокальным микроскопом принципиально другой. Освещение образца осуществляется сканированием его одним или более сфокусированным лучом, обычно лазерным (рисунок 2). Изображения, получаемые сканированием образца, таким образом, называются оптическими срезами. Эта терминология относится к неинвазивному методу исследований, когда изображения получаются с помощью сфокусированного света, а не физическим рассечением образца.

Рис. 2. Широкопольное и точечное сканирование образцов

Конфокальная микроскопия значительно упростила исследование живых образцов, сделала возможным получение данных в трех измерениях (z-серия) и более совершенным процесс получения изображений мультиокрашенных образцов. На рисунке 3 сравнивается традиционное изображение, полученное при исследовании в свете флуоресценции с эпископическим осветителем с конфокальным изображением, одних и тех же участков тотального препарата куколки бабочки с эпителием, окрашенным иодидом пропидия. Очевидно впечатляющее повышение разрешающей способности и, как следствие, резкости изображения ядер на снимке ЛСКМ, благодаря исключению внефокусного флуоресцентного свечения.

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ)

ЛСКМ - сейчас наиболее распространенная версия конфокальных микроскопов, применяемых в биомедицине. Во введении особое внимание уделяется именно ЛСКМ, поскольку конструкция и устройство эти микроскопов позволяет работать с ними даже начинающим пользователям. Другие конструктивные решения заняли свои специальные ниши в биологии. Для любой модели Или модификации конфокального микроскопа применимо, с незначительными изменениями, большинство правил подготовки образцов, также как и для других методик, основанных на оптических срезах, таких как деконволюционная и многофотонная методики.

Развитие конфокальной микроскопии

Считается, что изобретение конфокального микроскопа принадлежит Марвину Мински, который создал рабочий микроскоп в 1955 году. Развитие конфокальной микроскопии было во многом вызвано желанием наблюдать биологические процессы в живой ткани (in vivo) (в организме), и Мински ставил перед собой цель получить изображение нейронной сети в неокрашенном препарате живого мозга. Принципы конфокальной микроскопии, выдвинутые Мински и запатентованные в 1957 году, применяются во всех современных конфокальных микроскопах. На рисунке 1 поясняется конфокальный принцип, в применении к эпифлуоресцентной микроскопии, положенный в основу всех современных конфокальных систем, используемых при получении флуоресцентных изображений. В первоначальной конфигурации Мински использовал точечное отверстие (диафрагму), помещенную напротив циркониевого дугового источника света, используемого в качестве точечного источника света.

Рис. 3. Эпителий крыла бабочки

Свет от точечного источника фокусировался в виде точки объективом на заданной фокальной плоскости в образце и, проходя через него, фокусировался вторым объективом на второй точечной диафрагме (точечном отверстии), находящейся в фокусе с первой (они являлись софокусными, т. е. конфокальными). Лучи, проходящие через второе точечное отверстие, попадали на фотоумножитель с низким уровнем шума, генерирующий сигнал в зависимости от яркости света, исходящего от образца. Второе точечное отверстие отсекало от фотоумножителя свет, идущий из областей выше или ниже фокальной плоскости в образце. Использование пространственной фильтрации для исключения внефокусного света и засветок при работе с образцами толще фокальной плоскости является ключевым принципом конфокальной микроскопии. В своих работах Мински также описывал отражательный микроскоп с одним объективом и дихроматическим зеркалом, конструкция которого стала основой используемых сейчас систем.

Чтобы получить изображение конфокальным методом, необходимо выполнить сканирование образца сфокусированным в точку светом. В оригинальном приборе, собранном Мински, луч света был неподвижен, а сам образец двигался на вибрирующем предметном столике. Неподвижность сканирующего луча относительно оптической оси микроскопа являлась преимуществом этой установки, так как это позволяла исключить большинство дефектов оптики, которые могли бы исказить изображение. Однако, при исследования биологических образцов это могло вызывать колебания и дисторсию, в конечном итоге, приводило к потере разрешающей способности и четкости изображения. Более того, при перемещении предметного столика и образца, невозможно выполнить никаких манипуляций, таких как, например, микроинъекции флуоресцентно окрашенных клеток.

Но, независимо от способа сканирования образца, необходимо получить его изображение. А первоначальная схема Мински не создавала действительного изображения, так как выходной сигнал фотоумножителя подавался на использовавшийся в вооруженных силах осциллограф с длительным послесвечением, не имеющий записывающего устройства. Позже Мински писал, что не слишком впечатляющее качество его изображения было следствием не низкой разрешающей способности самого микроскопа, но дисплея осциллографа. Сейчас понятно, что из-за отсутствия технологий Мински не мог в полной мере продемонстрировать весь потенциал конфокального метода, особенно при визуализации биологических структур. Он указывал, что быть может именно это стало причиной того, что конфокальная микроскопия не сразу была воспринята весьма требовательным сообществом биологов, для которых всегда было приоритетно качество получаемых изображений. В то время в их распоряжении были световые микроскопы с превосходной оптикой, позволяющие наблюдать и фотографировать цветные яркоокрашенные гистологические срезы на высокочувствительную цветную пленку. В современных конфокальных микроскопах изображение формируется из сигналов, поступающих с фотоумножителя или улавливаемых цифровой камерой со встроенным прибором с зарядовой связью, непосредственно обрабатывается компьютерной системой работы с изображениями, выводится на экран с высоким разрешением и на устройство документирования изображений превосходного качества. Схема современного лазерного сканирующего конфокального микроскопа приведена на рисунке 4.

Рис. 4. Схема современного лазерного сканирующего конфокального микроскопа

Базовая оптика оптического микроскопа принципиально не менялась в течение десятилетий, поскольку конечное разрешение прибора определяется длиной волны, объективом и свойствами самого образца. Красители, используемые для усиления контраста образцов, и другие методы оптической микроскопии значительно улучшились за последние 20 лет. Подъем и совершенствование конфокального метода явились следствием возрождения оптической микроскопии, вызванного, во многом, успехами современных технологий. Многие технологические достижения, которые могли бы быть полезными в конструкции Мински, постепенно становятся доступными (в том числе и по цене) для биологов и других микроскопистов. Среди них, стабильные многочастотные лазеры, используемые в качестве улучшенных точечных источников света, усовершенствованные дихроматические зеркала, чувствительные малошумящие фотоприемники, быстродействующие микрокомпьютеры с усиленными возможностями (благодаря доступности памяти с большой емкостью), сложное программное обеспечение для работы с изображениями, мониторы с высоким разрешением и цифровые принтеры.

Эти технологии развивались независимо, и с 1955 года постепенно встраивались в конфокальные системы визуализации. Например, методы обработки цифрового изображения впервые были успешно применены в начале 80-х исследователями океанографического института Вудз Хоул (Woods Hole Oceanographic Institute). Используя, в их терминологии, «видео-микроскопы», они смогли получить изображения клеточной структуры микротрубок, размером меньше теоретического предела разрешающей способности оптического микроскопа. Очевидный рост разрешения стал возможен благодаря цифровой оптимизации изображений, захватываемых высокочувствительной суперкремниконовой (SIT) видеокамерой, соединенной с цифровым процессором изображений. Клеточные структуры были визуализованы с помощью оптики, работающей на дифференциальном интерференционном контрасте (ДИК), и дальнейшей обработки изображений цифровыми методами.

Классификация конструкций конфокальных микроскопов обычно основывается на методе сканирования образца. Существует два основных способа сканирования: сканирование предметного столика и сканирование осветительного луча; и, по крайней мере, два способа сканирования луча. В основу первоначального прибора Мински была положена система сканирования предметного столика, приводимая в движение примитивным камертонным генератором, которая создавала изображение довольно медленно. Современные конфокальные установки со сканированием предметного столика, ушедшие далеко вперед от своих прототипов, используются, в основном, в материаловедении, например, в производстве микрокристаллов. Системы, основанные на этом принципе, стали в последнее время популярны в областях биомедицины, где проводится анализ ДНК на микрокристаллах.

Более практичной альтернативой формирования изображений биологических систем является сканирование стационарного образца лучом. Этот принцип лежит в основе многих измерительных систем, усовершенствование которых привело к появлению популярных сегодня исследовательских микроскопов. В данном введении мы не касаемся технических деталей конфокальной микроскопии, но, по существу, в ней используются два принципиально отличных метода сканирования луча: многолучевое сканирование и однолучевое сканирование. Однолучевое сканирование на сегодня наиболее распространено, и именно этот метод применяется в ЛСКМ. Здесь сканирование луча производится с помощью управляемых компьютером зеркал, приводимых в движение гальванометрами со скоростью один кадр в секунду. Для достижения более быстрого сканирования, приблизительно с частотой видео кадров, в некоторых системах применяется акустооптическое устройство или колеблющиеся зеркала. В альтернативном методе используют два луча для сканирования почти в реальном времени, при этом обычно применяется разновидность вращающегося диска Нипкова. Эти системы явились результатом модификации и доводки спаренных (тандемных) сканирующих микроскопов (TSM), с целью создания более эффективных моделей для создания изображений флуоресцентно-окрашенных образцов. На рисунке 5 показана такая усовершенствованная система со спаренными дисками Нипкова и микролинзами для повышения чувствительности к слабому флуоресцентному свечению при создании изображения в реальном времени.

Рис. 5. Оптическая схема на основе дисков Нипкова

На сегодняшний день в конфокальной микроскопии существуют два альтернативных метода получения оптических срезов: метод деконволюции и многофотонный. Они различаются технически, но, как и конфокальные методы, основываются на традиционной оптической микроскопии. Деконволюция основана на вычислительных алгоритмах расчета и удаления той информации, которая поступает при создании изображения из внефокусных областей. Эта методика стала весьма удобной благодаря эффективным алгоритмам и высокопроизводительным миникомпьютерам. Многофотонная микроскопия использует ту же сканирующую систему, что и ЛСКМ, но не требует наличия точечной диафрагмы в приемнике. В ней нет необходимости, так как лазер возбуждает флуорохромную метку только в точке фокуса, исключая тем самым внефокусное излучение. При наблюдении живых тканей у этого способа появляются дополнительные преимущества, а именно: снижение фотообесцвечивания, поскольку уменьшается количество энергии, передаваемой лазерным лучом и поглощаемой тканями образца.

Традиционный оптический микроскоп представляет собой базу, на которой строится ЛСКМ. Вместо вольфрамовой или ртутной лампы применяется лазер, который связан с чувствительным фотоумножителем (ФЭУ) и компьютером, управляющим сканирующими зеркалами и другими сканирующими устройствами, а также облегчающим сбор и представление изображений. Полученные данные хранятся на цифровых носителях и могут быть обработаны с помощью многочисленных пакетов программ, либо на компьютере самой системы, либо на каком-нибудь другом.

По конструкции ЛСКМ, освещение и прием (регистрация) сигнала ограничиваются точкой на образце с дифракционным пределом. Объективы микроскопа сводят пятно освещения в фокус, и сканирующее устройство выполняет сканирование образца этим пятном под управлением компьютера. Сигналы от светящихся точек образца попадают в фотоумножитель через точечную (или, в некоторых случаях, щелевую) диафрагму, а выходные сигналы ФЭУ формируются в изображение и визуально воспроизводятся компьютером. Хотя неокрашенные образцы можно наблюдать в отраженном от образца свете, обычно они окрашиваются одной или более флуоресцентными красителями. Один из наиболее распространенных ЛСКМ, описанный в литературе примерно в 1990 году, был разработан в ответ на фундаментальную проблему, с которой столкнулись биологии-исследователи. Многие структуры и отдельные макромолекулы внутри иммунофлуоресцентно окрашенных зародышей невозможно визуализировать традиционным эпифлуоресцентным микроскопом после двухклеточной стадии, поскольку при возрастании числа клеток объем эмбриона остается примерно таким же. Это означает, что при более плотном расположении клеток усиливается свечение от клеток вне фокальной плоскости, что приводит к ухудшению разрешения изображения.

Рис. 6. Конфигурация лазерного сканирующего конфокального микроскопа Nikon

Группа исследователей, работающих над этой проблемой, обнаружила, что ни одна из доступных в то время конфокальных систем не отвечает их требованиям. На то время микроскопы со сканированием предметного столика работали слишком медленно. На создание одного изображения уходило примерно 10 секунд, а приборы с многолучевым сканированием еще не подходили для флуоресцентной визуализации с практической точки зрения. ЛСКМ был разработан таким образом, чтобы удовлетворять требованиям традиционной эпифлуоресцентной микроскопии и, наряду с другими, разрабатываемыми в то же время, стал прообразом сложных систем, предлагаемых сейчас биомедицинскому сообществу различными фирмами. Пример применяемой сегодня системы (Nikon E1000) приведен на рисунке 6.

В специально разработанных приборах толщина оптических срезов может меняться с изменением диаметра точечного отверстия перед фотоприемником. В сравнении с другими конструкциями с фиксированным размером точечного отверстия эта дополнительная функция оказывается чрезвычайно гибкой при визуализации биологических структур. Изображение может быть увеличено без потери разрешения за счет сокращения сканируемой площади образца и помещения отсканированной информации в массив данных того же размера для хранения и визуального представления (подобным образом меняется увеличение и в сканирующем электронном микроскопе). Благодаря этому у одного объектива появляется интервал изменения масштаба, что может быть чрезвычайно полезным при визуализации редких или скоротечных событий, которые могут быть пропущены или потеряны при смене объектива.

Благодаря детально проработанным и гибким возможностям ЛСКМ, предлагаемых сейчас коммерческими фирмами по приемлемым ценам, в последние годы произошел взрыв популярности конфокальной микроскопии, когда многие многопользовательские лаборатории предпочитают это оборудование электронным микроскопам. Преимуществом конфокальной микроскопии является относительная легкость, с которой могут быть получены высококачественные изображения образцов, приготовленных для традиционной оптической микроскопии, и большое число приложений в различных областях исследований.

Первое поколение ЛСКМ хорошо работало с зафиксированными образцами, но им не удавалось контролировать световую энергию лазеров, что слишком часто приводило к фатальному разрушению живого образца, если не предпринимались серьезные меры предосторожности. Несмотря на эти ограничения, изображения зафиксированных образцов были настолько качественными, что конфокальный подход был безоговорочно принят специалистами. В приборах последующих поколений был усовершенствован каждый аспект процесса визуализации. В дополнение к этому, новые приборы стали значительно эргономичней и удобней в работе, так что юстировка, смена комбинации фильтров, регулировка мощности лазера, производимые с помощью компьютера, стали гораздо легче и быстрее. Сейчас возможно снимать изображения с тремя флуорохромами одновременно, а последовательно - с еще большим числом. Благодаря усовершенствованному и более надежному программному обеспечению, повышению быстродействия компьютеров, увеличению емкости дисков и падению цен на оперативные запоминающие устройства, процесс обработки изображения тоже значительно продвинулся вперед.

Режимы формирования изображения

Основным применением конфокального микроскопа является получение изображений толстых образцов различного типа. Преимущество конфокального метода проистекает из возможности создавать изображения образца как последовательность отдельных оптических срезов высокой четкости и разрешения. При этом используется несколько режимов визуализации; в основе каждого из них лежит оптический срез, как базовая единица изображения.

Рис. 1. Оптические срезы, меченные тремя метками

Отдельные оптические срезы

Оптический срез является базовой единицей изображения в методах конфокальной микроскопии. Могут быть получены изображения связанных и окрашенных образцов в режиме одно-, двух-, трех- и многоволнового освещения, при этом изображения мультиокрашенных образцов, будут совмещены друг с другом (если используются объективы с адекватной коррекцией хроматической аберрации). Дополнительное совмещение обычно производится методами цифровой обработки изображения. Большинству лазерных сканирующих конфокальных микроскопов (ЛСКМ) требуется примерно 1 секунда на получение оптического среза, хотя, обычно, изображения нескольких оптических срезов усредняются для улучшения отношения сигнал - шум. Время получения изображения, конечно, зависит от размеров изображения в пикселях и быстродействия компьютера системы. Для хранения типичного 8-битного изображения размером 768×512 пикселей потребуется около 0.3 Мбит памяти.

Представленные на рисунке 1 оптические срезы получены одновременно при облучении возбуждающим светом трех различных длин волн (488, 568 и 647 нанометров) при использовании одного криптонового / аргонового лазера в качестве источника излучения. В качестве образца представлен имагинальный диск крыла дрозофилы на третьей возрастной стадии, в котором помечены три гена, участвующих в формировании крыла. Три представленных гена и соответствующие флуорохромные метки таковы: (a) рудиментарный (флюоресцеин - 496 нанометров); (b) бескрылый (лиссамин родамин - 572 нанометров); и © CiD (цианин 5 - 649 нанометров). Комбинированное изображение трех пространственно представленных доменов генов, формирующих крыло, располагается внизу справа (изображение (d)).

Съемка в заданный временной интервал и визуализация живой клетки

Исследования живых клеток в заданный временной интервал приобрело новый импульс благодаря повышению разрешающей способности ЛСКМ. Ранее исследования движений клеточных структур проводились с использованием 16-миллиметровой фотопленки и интервалометром с часовым механизмом, соединенным с фотокамерой, позже с помощью видеомагнитофона с функцией цейтраферной съемки, оптического устройства записи на диск или платой оцифровки видеоизображений. Сейчас с помощью ЛСКМ можно получать оптические срезы через определенные, предварительно заданные интервалы в режиме реального времени.

Визуализация живых тканей с помощью ЛСКМ гораздо сложнее, чем получение изображения связанных образцов, и не всегда возможна практически, поскольку образец может не выдержать условий наблюдения. В таблице 1 приведены некоторые факторы, которые необходимо учитывать при наблюдении живых и связанных клеток с помощью ЛСКМ. Некоторые образцы просто физически невозможно поместить на предметный столик микроскопа, или они не смогут оставаться живыми на нем в течении всего периода наблюдения. Исследуемое явление или структура могут не попадать в поле зрения объектива. Например, имагинальные диски крыла дрозофилы развиваются слишком глубоко в личинке, поэтому их невозможно наблюдать; а после препарирования, они не могут развиваться в культуре. Поэтому сегодня единственный доступный метод наблюдать экспрессию генов в тканях такого типа - рассечь личинку, связать и окрасить имагинальные диски, взятые из образцов на разных стадиях развития.

Табл. 1. Наблюдение связанных и живых клеток с помощью ЛСКМ

Успешное наблюдение и создание изображений живых клеток требует чрезвычайной осторожности в течение всего процесса, Обязательным условием является поддержание приемлемых условий на предметном столике микроскопа. Повреждения, наносимые клетке при облучении лазерным лучом, могут накапливаться при многократном сканировании, поэтому это воздействие должно быть сведено к минимуму, необходимому и достаточному для получения изображения. В культуральную среду обычно добавляются антиоксиданты, например аскорбиновая кислота, для сокращения кислорода, выделяемого при облучении флуоресцентных молекул светом возбуждения, и способствующего образованию свободных радикалов, убивающих клетки. Обычно необходимо проводить всесторонние предварительные контрольные опыты для оценки влияния облучения на флуоресцентно окрашенные клетки, внимательно следя за соответствием всех параметров изображения проводимому наблюдению. Вслед за пробными изображениями необходимо оценить жизнеспособность живых образцов. Эмбрионы, например, должны продолжать свое нормальное развитие в течение всего процесса наблюдения, поэтому необходимо выявлять любые аномалии, вызванные воздействием облучения или флуорохромами. На рисунке 2 представлена съемка в заданный временной интервал эмбриона дрозофилы, флуоресцентно окрашенного зеленым кальцием. Серия снимков показывает изменение распределения флуоресцентного свечения во времени.

Каждый тип клеток требует своих мер для поддержания их жизнеспособности в процессе наблюдения. Для некоторых клеток насекомых достаточно поддержания комнатной температуры и наличия достаточно большого объема подходящей среды. Однако, большинство типов клеток требуют подогрева предметного столика и, иногда, перфузионной камеры для поддержания необходимого баланса углекислоты в течение их нахождения на предметном столике. Выбор типа клеток, для которых условия наблюдения с помощью ЛСКМ наименее «враждебны», поможет избежать многих экспериментальных проблем. Усовершенствования современных конфокальных приборов привели к существенному сокращению потенциальных проблем. Повышенная квантовая эффективность, большая числовая апертура (яркость) объективов и использование менее токсичных красителей для клеток привели к тому, что конфокальная микроскопия стала практичным методом анализа живых клеток. Необходимо стремиться к использованию лазеров меньшей мощности, позволяющих, в то же самое время, выполнять регистрацию и обработку изображений как можно быстрее. Если для ускорения сбора и регистрации изображений увеличивается апертура точечной диафрагмы (по сравнению с наблюдением неживых образцов), то последующая деконволюция может иногда восстановить потерянное качество снимка.

Рис. 2. Съёмка в заданный временной интервал

Многие физиологические процессы и события протекают слишком быстро, и поэтому не могут быть захвачены большинством ЛСКМ, скорость визуализации которых в среднем один снимок в секунду. ЛСКМ, использующие акустооптические устройства и щелевые диафрагмы, быстрее возбуждаемых гальванометром точечных сканирующих систем и более практичны для физиологических исследований. Эти более быстрые установки соединяют хорошее пространственное и временное разрешение, которое может достигать 30 кадров в секунду при полноэкранном разрешении, или быть близким к скорости видео изображения. В более медленных микроскопах, со сканированием через точечное отверстие, временное разрешение может быть увеличено только за счет уменьшения области сканирования образца. Если необходимо полное пространственное разрешение, частота кадров должна быть уменьшена, что ведет к потере временного разрешения. Конфокальные системы, в которых применяются сканирование диском или колеблющимся зеркалом, также способны визуализировать быстрые физиологические процессы или другие скоротечные события.

Z-серия и трехмерные изображения

Z-серия - это последовательность оптических срезов образца, выполненных на разных уровнях в плоскости, перпендикулярной оптической оси (z-ось). Z-серии изображений получаются путем согласования пошаговых изменений в тонкой фокусировке микроскопа с последующим получением изображения на каждом шаге. Пошаговое перемещение фокуса обычно выполняется шаговым двигателем под управлением компьютера, который изменяет фокус на заданную величину. С помощью макропрограммы компьютера можно получить и сохранить изображение, перефокусировать микроскоп на заданную глубину в образце, получить и сохранить второе изображение, опять произвести рефокусировку в новой плоскости и так далее, пока не будет получено запрограммированное число изображений.

Нужные изображения могут быть взяты из z-серии, полученной при съемке выбранной области образца и обработаны специальной программой для последующего детального исследования определенных клеток, представляющих интерес. Z-серия может быть представлена как фотомонтаж изображений, как, например, на рисунке 3. Этот тип комбинации и отображения изображений, а также многие другие операции с изображениями, входит в стандартный набор свойств современных пакетов программного обеспечения по работе с изображениями. Снимки на рисунке 3 являются выборкой из большей серии с еще более частым шагом по оси z. Зеленое свечение определяет периферийную нервную систему эмбриона дрозофилы, окрашенного антителом 22C10.

Рис. 3. Z-серия оптических срезов

По сериям из нескольких сотен оптических срезов образца, произведенных ЛСКМ, может быть трудно составить представление обо всем комплексе взаимосвязанных структур. Тем не менее, z-серия, после регистрации, является идеальным материалом для последующего трехмерного представления образца с помощью методик объемной визуализации. Этот подход сейчас повсеместно используется для прояснения отношения между структурой и функцией тканей в медицине и биологии. Важно задать правильный шаг z-сканирования образца определяемый шагом двигателя, изменяющего фокус; в этом случае снимок будет отражать действительную глубину образца.

До тех пор, пока образец остается неподвижным при его наблюдении, снимки z-серии, произведенной ЛСКМ, будут превосходно зарегистрированы, а сохраненные в цифровом формате, они будут относительно легко преобразованы в трехмерное представление образца. На рисунке 4 сравнивается отдельный оптический срез (a) с проекцией z-серии (b) и иллюстрируется ценность этой методики при визуализации периферийной нервной системы эмбриона дрозофилы, меченного антителом 22C10.

Шаг шагового двигателя, устанавливаемый оператором микроскопа, связан с толщиной оптического среза, но может иметь другое значение. Толщина оптического среза привязана к толщине среза образца, наблюдаемого в микроскоп, и зависит от объектива и диаметра точечной диафрагмы. В некоторых случаях, тем не менее, шаг фокуса может совпадать с толщиной оптического среза, и это может приводить к путанице.

Вслед за получением файла z-серии, его отправляют на обработку программой трехмерной реконструкции, специально разработанную для обработки конфокальных изображений. Такие программы обладают чрезвычайным быстродействием при использовании на графических станциях, но могут быть успешно использованы и на персональном компьютере или графической станции самого конфокального микроскопа, при достаточно быстром процессоре и наличии большой оперативной памяти. С помощью этих программ можно создавать как отдельные трехмерные представления образца, так и последовательность представлений, сменяющих друг друга, составленных по разным видам образца, что производит эффект вращения или других пространственных трансформаций и дает лучшее восприятие трехмерных свойств образца. Программа позволяет варьировать длину, глубину, производить объемные измерения, а также интерактивно менять специальные параметры изображения, такие как прозрачность образца, для выделения различных структур в разных уровнях образца.

Рис. 4. Оптический срез и проекция z-серии

Другой способ представления серии оптических срезов, взятых из последовательности снимков, полученных в заданный временной интервал - это трехмерное представление, в котором ось z имеет функцию временной оси. Этот подход полезен при визуализации физиологических изменений при развитии организма. Примером применения этого метода было прояснение динамики изменения концентрации кальция в процессе развития эмбрионов морского ежа. Цветовое кодирование оптических срезов, взятых на разной глубине - простой способ представления трехмерных данных. На практике, цвет (обычно красный, зеленый или синий) приписывается каждому оптическому срезу, полученному на разной глубине образца, а затем цветные изображения объединяются, и за счет изменения цветов с помощью программы обработки изображений достигается желаемый эффект.

Получение четырехмерных изображений

С помощью ЛКСМ, динамические явления, проявляющиеся в живых тканях или в процессе подготовки живых тканевых культур и отраженные в последовательности снимков, полученных в заданный временной интервал, могут быть представлены в четырехмерном виде, со временем в качестве четвертого измерения. Z-серии, полученные через определенные интервалы, представляют собой четырехмерные наборы данных: три пространственных измерения (x, y и z) и время, в качестве четвертого, что можно наблюдать с помощью программы 4D просмотра. Такие программы позволяют составлять и проигрывать как кинофильм, стереопары, взятые в разные моменты времени, или, альтернативно, обрабатывать и представлять воссозданные трехмерные изображения, снятые в разные моменты времени, как смонтированный фильма.

X-Z изображения

Если необходимо получить вид образца сбоку, как, например, вертикальный разрез эпителиального слоя, можно произвести x-z сечение одним из двух способов. Вид сбоку можно получить сканированием по одной линии образца (ось x) с разной глубиной (ось z), контролируя шаговым двигателем изменение фокуса, а затем объединяя всю серию срезов в единое изображение. Другим методом является использование опции плоскость разреза в программе воссоздания трехмерных изображений, когда вид сбоку выделяется из существующей z-серии оптических срезов. При формировании изображения эпителия крыла бабочки на рисунке 5, лазер сканировал по одной линии (горизонтальная черная линия на левом снимке) проникая в образец при разных значениях z-координаты, или глубины. X-z изображение, представленное на рисунке 5, было построено и представлено конфокальной системой визуализации. Эпителий крыла состоит из двух эпителиальных слоев, но, поскольку интенсивность флуоресцентного свечения падает с увеличением глубины проникновения лазерного луча в образец, четко визуализирован только верхний слой.

Рис. 5. Изображение в X-Z плоскости

Создание изображения в отраженном свете

Все ранние конфокальные микроскопы работали в отраженном, или обратно рассеянном свете. Используя отраженный свет, многие образцы в конфокальной микроскопии можно наблюдать неокрашенными, либо они могут быть помечены красителями с высокой отражающей способностью, как, например, иммунозолотом или микрокристаллами галогенидов серебра. Преимущество наблюдений в отраженном свете, особенно для живых тканей, состоит в том, что образец не подвергается фотообесцвечиванию. Но красители некоторых типов могут ослаблять лазерный луч. Другой потенциальной проблемой является то, что в некоторых микроскопах могут возникать внутренние отражения от оптических элементов на оптическом пути луча. Для многолучевых версий ЛСКМ и ЛСКМ со щелевой диафрагмой проблемы отраженного света не существует, а в тех микроскопах, где она есть, применение поляризаторов, визуализация областей без артефактов и смещение от оптической оси, помогают уменьшить проблему.

Создание изображений в проходящем свете

Любой из режимов визуализации в проходящем свете, обычно применяемый в микроскопии, может быть использован в ЛСКМ, включая фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст (ДИК), темное поле или поляризованный свет. Свет, прошедший через образец попадает на приемник проходящего света, сигнал которого, через волоконно-оптически й световод, направляется в один из фотоумножителей в сканирующей головке микроскопа. Изображения в проходящем свете и конфокальные эпифлуоресцентные изображения могут захватываться одновременно при использовании одного и того же луча от осветителя, что гарантирует их точную регистрацию. При объединении или синтезе изображений с помощью соответствующего программного обеспечения, может быть отражено точное положение меченых клеток в ткани. В некоторых исследованиях предлагается следующий содержательный подход: объединить неконфокальное изображение в проходящем свете с одним или более конфокальных флуоресцентных изображений меченых клеток того же образца. Такой подход позволит, например, определить пространственные и временные аспекты миграции субпопуляции меченых клеток в пределах популяции немеченых клеток в течение нескольких часов или даже лет.

Сегодня уже широко используется цветной приемник проходящего света, который принимает проходящие сигналы в красном, зеленом и синем цвете (RGB) для создания цветного изображения в реальных цветах, подобно тому, как это делается в некоторых цифровых цветных фотоаппаратах. Такой приемник особенно полезен для патологоанатомов, которые обычно наблюдают реальные цвета в тканях в проходящем свете и накладывают эти изображения на флуоресцентные данные для анализа.

В настоящей главе будут рассмотрены основные принцы, устройство, применение конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) на примере приборов фирмы Leica. Принцип КЛСМ – регистрация светового потока, исходящего из фокальной плоскости объектива при совпадении фокусов, т. е. диафрагма детектора должна быть позиционирована так, чтобы ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. В качестве источника освещения применяются лазеры и чувствительные детекторы для получения изображения.

Основная особенность КЛСМ состоит в возможности получения послойного изображения исследуемого объекта (например, клетки) с высоким разрешением и с низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового сканирования объекта сфокусированным пучком света от когерентного источника или столиком, использованием специфических флуоресцентных зондов и специальных методов ограничения световых потоков.

Системы сканирования в КЛСМ можно классифицировать следующим образом.

1. Сканирование лучом.

А) Зеркальные системы: однозеркальные, двухзеркальные, резонансные магнитоэлектрические.

Б) Световолоконные системы: одноволоконные, многоволоконные.

В) Сканирование объективом:

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по осям Х, Y;

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по оси Z.

Г) Акустооптические дефлекторы луча: два акустооптических дефлектора для сканирования по осям Х и Y.

Д) Дисковые системы:

· односпиральные односторонние и двухсторонние;

· многоспиральные односторонние и двухсторонние.

Е) Комбинированные системы: акустооптический дефлектор по оси Yи сканирование зеркалом по оси Х.

2. Сканирование столиком.

А) Шаговый привод: сканирующий столик с шаговыми двигателями по осям Х, Y, Z.

Б) Комбинированный привод: сканирующий столик с шаговым двигателем по осям X, Yи пьезоэлектрический привод по оси Z.

Рис. 5. Принципиальная схема работы КЛСМ.

1 - сканирующий столик; 2 - исследуемый образец; 3, 7 - объективы; 4 - сканирующее устройство; 5 - светоделительная пластина; 6 - луч света от лазера; 8, 12 - изображение точек В и С; 9 - игольчатая диафрагма; 10 - изображение точки А в центре игольчатой диафрагмы; 11 - приемник излучения; 13, 15 - свечение точек В и С, находящихся вне фокуса объектива 3; 14 - свечение точки А, находящейся в фокусе объектива 3.

Световой поток возбуждения 6 от лазерного источника поступает через светоделительную пластину 5, сканирующую систему 4 на объектив 3 и фокусируется в точку А плоскости исследуемого препарата (например, клетки), находящейся в фокусе. Полагаем, что внутриклеточные структуры связаны с флуоресцентными зондами и точку А фокусировки пучка можно рассматривать как точечный источник света, поток флуоресценции от которого через объектив 3, светоделительную пластину 5, объектив 7 фокусируется в плоскости игольчатой диафрагмы 9 ("pinhole") и регистрируется фотодетектором 11. Освещенность потоком возбуждения фрагментов препарата, лежащих вне фокуса объектива вдоль оптической оси (точки В и С), ниже, чем в точке А. Следовательно, составляющая освещенности мишени детектора от точек В и С может быть существенно уменьшена. Потоки флуоресценции, исходящие от точек В и С, лежащих вне фокуса, ограничиваются точечной диафрагмой и на детектор не попадают, либо попадает их малая часть. Таким образом, при сканировании препарата в плоскости XY детектором регистрируется сигнал, уровень которого определяется расстоянием от плоскости сканирования вдоль координаты Z. Совмещение фокуса объектива 3 с плоскостью сканирования и фокуса объектива 7 с игольчатой диафрагмой отражено в термине "конфокальность". Пошаговое перемещение плоскости сканирования вдоль оси Z позволяет получить серию контрастных послойных изображений и реконструировать внутреннюю трехмерную структуру (3-D) исследуемого объекта. Качество изображения, разрешение в плоскости XY и вдоль оси Z зависит от качества оптики, качества сканирующих систем, размеров и точности изготовления точечной диафрагмы, жесткости конструкции, эффективности используемых алгоритмов обработки сигналов, специфичности флуоресцентных зондов.

Для определения пространственной разрешающей способности микроскопа проводят анализ изображения точечного источника света. Изображение точечного источника, формируемое обычной линзой, представляет собой дифракционное пятно Эри, состоящее из яркого центрального ядра и более слабых внешних колец.

Рис. 6. Дифракционное пятно Эри.

Два точечных источника одинаковой яркости, расстояние между которыми равно d, видны как две различные точки, если расстояние между центрами кружков Эри превышает следующее значение:

r A = XY =0,6 λ/NA,

где r A - радиус первого темного кольца в кружке Эри, λ- длинна волны источника света в нм, NA – числовая апертура.

Это выражение называют критерием Рэлея. Оно определяет разрешающую способность микроскопа в плоскости образца (XY). При этом предел разрешения определяется прежде всего волновой природой света, и поэтому его часто упрощают, считая NA=1. В КЛСМ формирования изображения приводит к небольшому уменьшению размера пятна Эри. Интенсивность пятна Эри для стандартного микроскопа уменьшается по закону n -2 ,где n - поперечное смещение, а для КЛСМ интенсивность уменьшается как n -4 . Это приводит к увеличению разрешающей способности КЛСМ в 1,5 раза. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

XY c r =0,4 λ/NA,

где XY c r – разрешающая способность КЛСМ.

Для оценки преимущества КЛСМ, рассмотрим аппаратную функцию (структуру пятна Эри) и проанализируем разрешающую способность микроскопа в осевом направлении (Z). Трехмерное пятно Эри (распределение интенсивности), является трехмерной аппаратной функцией (ТАФ) которая определяет изображение объекта. ТАФ для обычного микроскопа имеет коническую форму, расширяющуюся вверх и вниз от центра, тогда как для конфокального микроскопа она имеет эллиптическую форму и менее вытянута в осевом направлении.

Рис. 7. Вид трехмерной аппаратной функции точечного источника обычного микроскопа – (а) и КЛСМ – (б).

Критерий Рэлея применим и для определения разрешающей способности микроскопа в направлении оптической оси. Для обычного микроскопа два точечных источника, расположенные на некотором расстоянии вдоль оптической оси, можно разрешить, если максимумы их пятен Эри находятся на расстоянии:

Z r =2 λ/NA 2 ,

где Z r - осевая разрешающая способность микроскопа.

Распределение энергии в пятне Эри для КЛСМ более узкое, и разрешающая способность в осевом направлении в 1,4 раза выше. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

Z r c =1,4 λ/NA 2 ,

где Z r c - осевая разрешающая способность КЛСМ.

Современные КЛСМ имеют одно главное преимущество - возможность получения тонких оптических срезов. На качество изображения при получении тонких оптических срезов влияют следующие параметры:

· размер конфокальной диафрагмы;

· числовая апертура объектива NA;

· показатель преломления;

· поглощение света в образце.

Уменьшение интенсивности света по мере увеличения толщины образца влияет на разрешение микроскопа по оптической оси Z. Разрешение зависит от оптики микроскопа и образца. Толщину оптического сечения в конфокальном микроскопе обычно характеризуют шириной распределения на полувысоте пика интенсивности ∆z 1/2 = 0,65мкм. Если образец и детектор идеальны, этот параметр зависит от числовой апертуры объектива, длины волны λ и показателя преломления иммерсионной среды n i .

Рис. 8. Зависимость осевой разрешающей способности микроскопа ∆z 1/2 от числовой апертуры объектива.

В КЛСМ перед детектором ставится регулируемая диафрагма, изменяющая количество света. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадающего в плоскость формирования изображения от точек, не совпадающих с фокальной плоскостью или находящихся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости. Размер игольчатой диафрагмы конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещенных относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости. Размер диафрагмы влияет на толщину получаемого сечения. Чем меньше диафрагма, тем ближе толщина сечения к теоретическому пределу (шириной распределения на полувысоте пика интенсивности), а при очень больших апертурах способность получать тонкое сечение становится невозможным.

Как говорилось ранее, КЛСМ дает возможность получать оптическое сечение на значительной глубине от поверхности образца, при этом важным моментом является показатель преломления и проблема глубины. Прохождение падающего и отраженного луча через образец влияет на качество изображения. Если показатели преломления иммерсионной среды и образца близки (влияние разности показателей преломления иммерсионной жидкости и объекта на появление рассеянного света, снижающего контраст изображения и действующего как эффект сферической аберрации), световой конус будет сходиться. Если же показатели преломления различаются, появляется сферическая аберрация.

Рис. 9. Показатели преломления иммерсионной среды и образца.

а – формирование изображения иммерсионным объективом без аберрации; б – сферическая аберрация, обусловленная несоответствием показателей.

При разных показателях преломления световые лучи, идущие на различном расстоянии от оптической оси, в одну точку не фокусируется, что приводит к потере качества изображения. По возможности показатели преломления образца и объектива должны быть согласованы. Если показатели преломления образца и иммерсионной среды различаются, изображение объекта на глубине размыто вдоль оптической оси, а плоскость фокуса сдвинута. Для увеличения глубины проникновения объектив должен иметь большую числовую апертуру, например иммерсионный объектив. Однако такие объективы имеют малое максимальное расстояние от линзы объектива до фокальной плоскости. На глубину проникновения влияет неоднородность образца, которая приводит к снижению интенсивности света на большой глубине и появлению тени. В идеале образец, позволяющий достичь максимальной глубины проникновения и максимального разрешения, должен иметь показатель преломления, равный показателю преломления объектива, но это однородный образец, а таких биологических образцов не существует.

Во время сканирования КЛСМ получает ряд оптических сечений с регулярно возрастающей глубиной от поверхности образца. Для большинства КЛСМ получение сотни 2D-изображений занимает всего несколько минут. Оптическое изображение можно получить двумя способами:

1) получение последовательности оптических сечений в плоскости XY, расположенных на расстоянии ∆z друг от друга. Сопоставление координат центров объектов в различных сечениях дает возможность определить их ориентацию и распределение по длине.

Рис. 10. Изучение трехмерной структуры в плоскости XY.

2) получение ряда оптических сечений в плоскости XZ, расположенных на расстоянии ∆y. Если образец параллелен плоскости сечения, то его сечение в плоскости XZ будет почти круглым, при сопоставлении изображений в различных XZ сечениях, можно определить изогнутость исследуемого объекта.

Рис. 11. Изучение трехмерной структуры в плоскости XZ.

Трехмерная реконструкция исследуемых объектов методами КЛСМ направлена на решение двух задач:

· визуализации объемного изображения объекта, полученного путем "сборки" его оптических срезов;

· количественного анализа внутренних структур объекта.

На сегодняшний день существует достаточно много фирм производителей КЛСМ. Инновации фирм-производителей КЛСМ:

· 2002 г. фирма Leica анонсировала акустооптический светоделитель (AOBS), позволяющий эффективно разделять лазерный луч возбуждения и люминесценцию;

· 2002 г. фирма Carl Zeiss начала выпускать конфокальный микроскоп LSM 510 META с оригинальным фотоприемником, регистрирующим сигнал одновременно в 32-х спектральных каналах;

· 2004 г. Zeiss создает высокоскоростной LSM 5 Live, имеющий скорость сканирования в 20 раз выше обычного КЛСМ;

· Фирма Olympus разработала прибор с двумя сканерами, позволяющий более эффективно применять, например, методику FRAP;

· Nikon - создает компактный и недорогой КЛСМ упрощенной конструкции;

· 2007 год фимра Leica объявила о выпуске 4Pi-конфокального микроскоп, улучшающий аксиальное разрешение в 4 - 7 раз.

Рассмотрим устройство КЛСМ относящегося к новому более совершенному поколению приборов – TCS SP5 фирмы Leica.

Рис. 12. Многофотонная/конфокальная широкополосная система TCS SP5 (инвертированный микроскоп).

Ключевые элементы КЛСМ TCS SP5: AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр, AOBS – акусто-оптический светоделитель, SP-Detector – датчик спектрального фотометра.

AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр – служит для минимизации оптического экспонирования, настраивает мощность лазера в зависимости от образца и флуорохрома. Позволяет выбрать необходимую длину волны и управлять интенсивностью света возбуждения. AOTF - представляет собой электрически перестраиваемый фильтр, работающий на принципе объемной дифракции светового пучка на неоднородностях показателя преломления. Такие неоднородности возникают при возбуждении в двулучепреломляющих кристаллах ультразвуковой акустической волны. При анизотропной дифракции в одноосных кристаллах существует минимальная частота ультразвука, при которой углы падения и дифракции совпадают, и происходит так называемое коллинеарное акустооптическое взаимодействие.

Рис. 13. Акустико-оптический настраиваемый фильтр.

AOBS – акусто - оптический светоделитель, это акусто-оптический кристалл – настраиваемое преломляющее устройство, работающее в реверсивном режиме. Что дает использование AOBS:

1. Для получения четкого, с низким уровнем шума, изображения необходима высокая степень светопропускания. Уменьшение же шума за счет усреднения изображения по многим последовательным сканированиям с необходимостью приводит к фотообесцвечиванию изучаемого объекта. Степень светопропускания AOBS превосходит большинство дихроичных зеркал во всем видимом диапазоне спектра. Следовательно, требуется усреднение по меньшему числу сканирования. В результате препарат просуществует гораздо дольше;

2. Яркие и четкие изображения требуют прохождения как можно большего числа фотонов от объекта к детектору, что улучшает качество изображения. AOBS обеспечивает регистрацию максимально широких полос флуоресценции, то есть максимального числа фотонов;

3. Низкое обесцвечивание во время получения изображения важно для защиты образца от выцветания, а живых объектов от токсичных продуктов фотолиза флуорохромов. Кривые светопропускания AOBS имеют очень крутые наклоны, что позволяет регистрировать флуоресценцию флуорохрома максимально близко к полосе его возбуждения;

4. Может быть возбужден любой краситель видимого диапазона, так как отражение может настраиваться индивидуально;

5. Решен вопрос многопараметрической флуоресценции: можно запрограммировать до восьми линий излучения лазера, оставляя достаточно места для регистрации флуоресценции, при этом частоты настраиваются;

6. Соотношение красителей, как соотношение возбуждения метаболит - проб, например, для Са 2+ , мембранного потенциала, водородного показателя должно быстро переключаться при последовательном сканировании. AOBS переключается за несколько микросекунд;

7. Регистрация изображения в отраженном свете - еще одна возможность использования. AOBS позволяет настраивать прохождение отраженного возбуждающего света индивидуально;

8. Сканирование ROI (последовательное сканирование и сканирование определенной зоны) также улучшено: различные режимы возбуждения применимы для различных областей во время отдельного сканирования;

9. Большой объем 3D записей, в последовательном режиме выигрывает от устройств с быстрым переключением, так как скорость увеличивает эффективность системы;

10. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) требует низкого фона и малого светорассеяния Только AOBS эффективно блокирует близкие линии излучения, например, от Аr лазеров;

11. Спектральная запись (Лямбда сканирование) обеспечивает точный спектр, так как светопропускание AOBS «белое», а это значит, что он не вносит изменений в спектр испускания - что является обычной проблемой при выполнении спектрального сканирования в системе с дихроичными зеркалами;

12. Для истинного конфокального получения оптических срезов необходимо точечное освещение и точечная регистрация флуоресценции. AOBS подходит для работы с конфокальными устройствами точечного сканирования;

13. Получение изображения в мультифотонном режиме либо при ультрафиолетовом возбуждении может быть выполнено параллельно без ошибок или ограничений. AOBS не меняет возбуждение лазеров невидимого диапазона и не меняет спектр флуоресценции;

14. Невозможно выполнить ошибочную операцию, так как AOBS контролируется совместно с управлением возбуждения при помощи AOTF (акустико-оптический настраиваемый фильтр). Если выбрана линия возбуждения, то и AOBS запрограммирован в соответствии с ней. Оператору не надо принимать решения - работа выполняется правильно и автоматически;

15. Отсутствует разюстировка, так как нет подвижных элементов присущих фильтровым барабанам и слайдерам. Кристалл прочно установлен, программирование выполняется электронным способом;

16. Нет необходимости в дорогостоящем дополнительном оборудовании, например, фильтровых кубиков, слайдеров дихроичных зеркал и т.д. Поэтому гораздо меньше расходы на техническую помощь для установки новых оптических элементов.

Рис. 14. AOBS – акусто - оптический светоделитель.

SP-Detector – датчик спектрального фотометра. Свет от образца, являющийся суммой спектров вызванной флуоресценции проходит pinhole диафрагму, которая формирует конфокальный оптический срез. Далее при помощи призмы этот свет раскладывается в спектр. При прохождении первого детектора, свет проходит устройство щелевого фотометра, состоящего из двух шторок с приводом. Эти шторки обрезают края спектра с обеих сторон диапазона и направляют к сенсорам 2 и 3 порядка. В итоге спектр раскладывается одновременно на пять каналов. В итоге при использовании SP – детектора регистрируется излучение от различных красителей в образце.

Рис. 15. Спектральный детектор SP.

SP – детектор позволяет производить лямбда-сканирование: спектральные изображения накапливаются для анализа характеристик красителей, задействованных в эксперименте, сразу.